Разработка методов и средств реабилитации объектов отравляющих веществ (стр. 6 из 8)

Для приготовления твердой среды MS1 добавляют к вышеописанной жидкой среде агар-агар 18 г/л, стерилизуют в подобных условиях. Глутамат и МФК вносят после расплавления среды перед разливом в чашки Петри.

Музейную культуру, хранящуюся в холодильнике при t 4-8⁰С на агаризованной среде MS1 с МФК, штрихом пересевают на твердую минеральную среду MS1 с теми же источниками фосфора и выращивают посевной материал в течение 2-3 суток при t 28-29⁰С.

Состав стоковых растворов:

Стоковый раствор 1. Растворить последовательно в 0,7л дистиллированной воды следующие навески (г): NH₄Cl – 200.0, MgSO₄x7H₂O – 20.0, CaCl₂x6H₂O – 1.0, довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 2. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды навеску (г): K₂SO₄ – 50.0. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 3. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды навеску (г): FeSO₄x7H₂O – 0,25. Довести рН до 4.0 20% H₂SO₄. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 4. Растворить последовательно в 0,5 л дистиллированной воды навески (г): CuSO₄x5H₂O – 0,2; ZnSO₄x7H₂O – 2,0; MnSO₄xH₂O – 0,1; NiCl₂x6H₂O – 0,005. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 5. Растворить последовательно в 0,5 л дистиллированной воды навески (г): H₃BO₃ – 0,006; Na₂MoO₄x2H₂O – 0,03. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

2.3 Методика проведения эксперимента по изучению возможности

деструкции метилфосфоновой кислоты и её эфиров

На поверхность чашки наносили 30-40 мл стерильной минеральной среды MS1 без источника углерода и фосфора, суспендируют клетки, собирают суспензию стерильной пипеткой и переносят в стерильную колбу. Туда же добавляют 7 мл стерильного стокового раствора 1М глутамата Na и инкубируют на качалке в течение 1-2 суток для получения клеток голодных по фосфору. Изменение значения рН в суспензии контролируют путем нанесения капли жидкости на полоску универсальной индикаторной бумаги. Это значение поддерживают на уровне 7.0 - 8.0 добавлением 20 % H₂SO₄ .

Культивирование бактерий проводят в 750 мл колбах на качалке со 180-200 об/мин при t 28-29⁰С. Засев среды производят суспензией голодных по фосфору с исходной оптической плотностью 0,1-0,15 ед. Для этого определить исходную оптическую плотность суспензии бактерий и провести необходимое разбавление до плотности 0,1-0,15 ед. В колбы, содержащие 100 мл жидкой среды MS1 добавляют 7 мл стерильного стокового раствора 1М глутамата Na и МФК или метилфосфонатов кальция, железа и алюминия из расчета 0,3 г на 1 л смеси. Изопропилового, изобутилового и пинаколилового эфиров из расчета 0,2 г на 1 л смеси.

Отбор проб для анализов проводят через 12 часов с обязательным контролем значения рН культуральной жидкости. Поддержание оптимального для роста значения рН 7.0-8.0 осуществляют путем внесения 20% стерильного раствора H₂SO₄ , либо 20% стерильного раствора NaОН.

Каждый опыт проводят минимум два раза, в опыте берут количество колб для культивирования также минимум в двух повторностях.

2.4 Методика контроля роста микроорганизмов

Рост культуры контролируют:

а) по изменению оптической плотности при длине волны 560 нм (ОП₅₆₀) в кювете 1 см. на спектрофотометре. Пересчет оптической плотности на вес сухой биомассы проводили согласно коэффициенту 0,5 (г сухих клеток/ед оптической плотности), полученному экспериментально для бактериальных культур, выделенных из почвы.

б) по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) путем высева из разведений на агаризованную среду LB. Последовательно культуральную жидкость разводят до необходимого разведения (10^-6-10^-8 клеток/мл). Для разведения использовали стерильный физ. раствор. Из пробирки с необходимым разведением берут 100 мкл культуральной жидкости, которую наносят на агаризованную среду LB и тщательно растирают шпателем. Чашки помещают в термальную комнату (t 28-29⁰С) на 2-3 суток. Затем подсчитывали количество колоний.

Состав среды LB: дистиллированная вода -1 литр, бакто-пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl –5 г, агар-агар – 18г, рН 7.0. Стерилизация: автоклавирование при 0,5 атм, 30 минут.

Для расчета скорости роста строят кривую роста, выраженную в логарифмах. По кривой роста определяли длину лаг-фазы и логарифмическую фазу роста.

Удельную скорость роста рассчитывают по формуле:

m = (ln ОП₂ - ln ОП₁)/(t₂ – t₁) час^-1

Экономический коэффициент мг органофосфонатов/г биомассы рассчитывают по формуле:

Q = D/(A/2),

где Q - экономический коэффициент, мг органофосфонатов/г биомассы;

А - оптическая плотность в стационаре;

D - количество метаболизируемой МФК.

2.5 Методика определения концентрации соединений с С-Р связью

Метод определения фосфат-иона основан на образовании окрашенного комплексного соединения между фосфором, молибдатом аммония и малахитовым зеленым в сильно кислой среде. Количество фосфора рассчитывают по результатам измерения поглощения образующегося комплексного соединения при длине волны 645 нм на фотоколориметре.

Содержание соединений с С-Р связью определяют по разнице между количеством общего и неорганического фосфора. Концентрацию фосфора общего определяют на спектрофотометре по образованию комплекса фосфомолибдата с малахитовым зеленым при низких значениях рН после гидролиза с персульфатом аммония, в ходе которого происходит разрыв С-Р связи и высвобождение фосфат-иона. Соотношение предварительно разведенной культуральной жидкости и персульфата аммония было 1:1.

Пробы культуральной жидкости отбирали в эппендорфы для анализа, центрифугировали 10 тыс. об./мин - 2 мин, супернатант хранили в замороженном виде для разрыва С-Р связи ГФ в стеклянных пробирках проводили гидролиз проб с персульфатом аммония. Для приготовления раствора персульфата 8 г персульфата аммония растворяли в 20 мл дистиллированной Н₂О. Смешивали пробу и раствор персульфата аммония в соотношении 1:1 в стеклянных пробирках, которые закрывали фольгой и закрепляли ее резиновыми кольцами. Гидролиз проводили в течение 60 мин. при 90⁰C на водяной бане.

Вносили в эппендорфы компоненты реакции в соотношении: 130 мкл 1н H₂SO_4-,130 мкл пробы, 1300 мкл раствора С. Смесь тщательно перемешивали. Через 10-15 минут измеряли ОП при длине волны 645 нм (ОП₆₄₅) в кювете 1 см, в линейной области значений ОП от 0,2 до 0,5. В качестве контроля использовали образец культуральной жидкости без добавления персульфата аммония.

Приготовление растворов:

Раствор А: 90 мг малахитового зеленого растворяли в 200 мл дистилированной воды при перемешивании в течение 30 мин. на магнитной мешалке;

Раствор В: 8,4 г молибдата аммония растворяли в 60 мл HСl конц в течение 20 мин. при перемешивании стеклянной палочкой; после растворения молибдата аммония в HCl конц. добавляли полученный раствор к 138 мл дистиллированной Н₂О.

Раствор С: смешивали по 200 мл растворов А и В, перемешивали в пластиковой емкости на магнитной мешалке в течение 30 мин., фильтровали полученный раствор С через плотный бумажный фильтр в пластиковую посуду. Раствор С использовали для анализа. Хранили в холодильнике, в течение надели. Перед каждым употреблением фильтровали через бумажный фильтр.

3. Обсуждение результатов

3.1 Отбор штаммов микроорганизмов-деструкторов

фосфорорганических соединений

Для скрининга использовали коллекцию штаммов Pseudomonas и Alcaligenes лаборатории института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. В качестве субстрата использовали МФК.

Образование зон «просветления» на среде, содержащей МФК, представлено на рисунке 6.

Рисунок 6 – Образование зон «просветления» различными штаммами

1 – KR31; 2 – Sm12; 3 – Km12; 4 – 2-79; 5 – Pf-5; 6 – Q₂ – 87; 7 – CHAQ1;

8 – Sm11; 9 – UC 5; 10 – PCLB 91; 11 – 38а; 12 – 53a; 13 – 54; 14 – 1217;

15 – 7Н; 16 – 90Н; 17 – 70А; 18 – IG1; 19 – OV17; 20 – 1С7; 21 – IIД 5;

22 – VB1; 23 –OV9; 24 – 29; 25 – 19; 26 – 25р; 27 – AS15.

Как видно из рисунка 6, наибольшей способностью к усилению растворения МФК обладают штаммы 2-79, Pf-5, P54, 1C7, относящиеся к роду Pseudomonasfluorescens. Наилучшая способность к растворению метилфосфонатов отмечается у штамма Sm11 , относящегося к роду Alcaligenessp.

Таким образом, биодоступность МФК можно достичь внесением в почву штамма Sm11 бактерий рода Alcaligenessp. Поэтому для изучения эффективности биодеструкции фосфорорганических соединений выбран именно этот штамм.

3.2 Биодеструкция метилфосфоновой кислоты и её кислых эфиров

Из литературных данных известно, что неорганический фосфат ингибирует потребление органофосфонатов в качестве источника фосфора разложение МФК [33-35]. При выращивании посевного материала на агаризованной среде, по-видимому, возможна экстракция из агара и накопление в клетках более доступных, чем МФК, источников фосфора, которые могут попадать в экспериментальную среду вместе с посевным материалом. Более доступный фосфор может находиться на поверхности агара, образуясь в процессе жизнедеятельности культуры из МФК при наращивании биомассы. Поэтому, к тому времени, как биомасса на агаризованной среде нарастет до необходимого уровня, в клетках посевного материала могут быть запасные источники фосфора, за счет которых культура будет расти в среде с МФК, не разлагая его. Чтобы исключить все эти факторы необходимо иметь клетки посевного материала, голодные по фосфору. Для решения этой проблемы необходимо суспензию клеток, используемую в качестве посевного материала, инкубировать в среде с глутаматом (источником углерода), но без источника фосфора в течение трех суток. В это время можно считать клетки голодными по фосфору.

Подготовленный посевной материал использовали для засева опытных колб с концентрацией МФК (метилфосфонатов) 0,3 г/л. Рост культур контролировали по изменению оптической плотности и контролировали изменение содержания органического фосфора и значение рН. По данным измерений оптической плотности и концентрации загрязнителя строили кривые роста культур и потребления источника фосфора (рисунок 7 и 8).