Прямой способ. Антитела нанесены на твердую фазу, ферментная метка вводится в антиген. Преимущества – небольшое число стадий и, соответственно, возможность автоматизации определения. Недостатки – сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных коньюгатов (промежуточная стадия иммунной реакции), а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента
Непрямой способ. Антиген наносится на твердую фазу, ферментной меткой отмечаются вторичные антитела, полученные против иммуноглобулинов соответствующего типа. Достоиством этого способа является возможность устранения влияний различных эффектов на каталитические свойства ферментов.
На основе иммуннохимического метода создано множество тест-систем. Они реализуются обычно на микропланшетах или в пробирках. С помощью тест-систем определяются гормоны и лекарства в сыворотке крови. Кроме того, на основе иммунной реакции создаются биосенсоры.
Электроаналитические методы в биомедицинских исследованиях
Еще на заре развития электрохимических методов анализа (ЭМА) объекты биологии, медицины и фармации привлекали внимание исследователей. Это прежде всего относится к классической полярографии, в меньшей мере к потенциометрии и вольтамперометрии. В 30-х годах XX века чешский исследователь Брдичка обнаружил каталитические волны белков в аммонийно-аммиачных буферных растворах в присутствии солей кобальта. Впоследствии этот метод был применен в медицине для диагностики рака, а затем и для других заболеваний. Он известен как серологическая реакция Брдички. Достижения классичекой полярографии в биологии, медицине и фармации обобщены в монографии М. Бржезины и П. Зумана, которая оказала самое плодотворное влияние на развитие этой области ЭМА. Большая часть пионерских работ в этой области анализа были выполнены исследователями, которые имели базовое образование фармацевта, что не могло не сказаться на применении этого метода в биомедицинских исследованиях.. С помощью методов ВА определяли различные метаболиты, белки, идентефицировали ферменты, оцнивали их активность по продуктам ферментативных реакций, исследовали процессы в микроорганизмах, суюклеточных культурах, в тканях по продуктам их жизнедеятельности. Кроме того, эти методы применяли для получения электрохимических характеристик веществ, участвующих в переносе электронов в процессе дыхания и фотосинтеза, при моделировании окислительно восстановительных процессов в живой клетке, а также для исследования структурных особенностей биологических макромолекул и биомембран и т.д. В 60-х годах с появлением ионоселективных электродов (ИСЭ) стало возможным потенциометрическое определение катионов и анионов как invitro, так и invivoв растворах, включая цельную кровь.
Прогресс в области ионометрии и разработки новых ИСЭ с улучшенными характеристиками, в частности, на основе полевых транзисторов привел к появлению разнообразных потенциометрических сенсоров, устройств и приборов для определения органических и неорганических, в том числе и лекарственных, соединений в различных условиях (в потоке жидкости, в очень малых объемах растворов и т.д.). Современная биохимическая лаборатория имеет возможность использовать ионометрические установки как для прямого определения, так и для потенциометрического титрования в водных и неводных средах.
Достигнутые успехи не означали отсутствие проблем, обусловленных перманентными требованиями к необходимой воспроизводимости, надежности, чувствительности, а также селективности определений, особенно для электродов-сенсоров с амперометрическим откликом, которые порой трудно достигались, поскольку компоненты, определялись в сложных по составу матрицах. Потенциометрические сенсоры на основе мембран с включенными в них электроактивными органическими соединениями показали достаточно высокую селективность при определении этих же соединений в испытуемом растворе. Их используют при анализе порошков, суппозитарий, таблеток и других лекарственных форм; при этом не требуется сложная пробоподготовка.
Новый этап развития ЭМА применительно к обсуждаемым объектам связан с применением имообилизированных биоматериалов как реагентов нового поколения для модифицирования электродов и создания на их основе биосенсоров.
Функциональо биосенсоры сопоставимы с датчиками живого организма – биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающие из окружающей среды, в электрические, которые легко измерить.
Биосенсоры, с одной стороны, можно рассматривать как устройства, работающие на принципах биологического распознавания определяемых молекул или других частиц. Поэтому их можно отнести к категориям биологических и биохимических методов анализа.
С другой стороны, биосенсоры – это биоэлектронное устройство, включающее чувствительный элемент, тесно связанный с физическим преобразователем либо интегрированный с ним, чаще всего с электродом. Интерес к биосенсорам обусловлен их широким потенциальным применением в контроле состояния окружающей среды и охране здоровья человека.
Многообразие биосенсоров объясняется различной природой биоматериала, типом физического преобразователя, способами регистрации электрического сигнала. Сама их конструкция может быть тесно связана с применением.
Что касается метода регистрации, то при интегральной оценке развития ЭМА периода последних 5-15 лет в аспектах биологии и медицины, можно увидеть возрастание удельного веса ВА и родственных методов среди других.
Сейчас наблюдается заметное проникновение идей супрамолекулярной химии в область ЭМА. Молекулярный дизайн и нанотехнология в создании новых электродов и на их основе микроаналитических систем для целей медицинской диагностики теперь рассматривают как еще один путь развития электроанализа и расширения сфер его применения. Самоорганизующиеся монослои (СОМС) на поверхности электродов – это частный случай высокоупорядоченных слоев с точно контролируемой толщиной и направленной ориентацией молекул – представляют уникальную возможность для изучения фунтдаментальных аспектов электроаналитической химии, включая процессы накопления определяемого компонента, селективность СОМС, факторы, влияющие на величину сигнала.
С помощью субстратных биосенсоров определяют широкий круг различных физиологически важных соединений или их метаболитов в растворе или непосредственно в организме человека: глюкозу, мочевину, спирты, органические кислоты и т.д., и решают проблему диагностики заболеваний.
Структура биоаналитики: методы электроанализа в определении компонентов в объемах биомедицинского назначения и фармации
| Способ определения | Определяемый компонент | Тип сенсора |
| Потенциометрия | H+, K+, NH4+, Na+, Cl-, Mg+, Ca+, NO2-, NO3-, катионы и анионы органичеких оснований и кислот, аскорбиновая кислота, спирты, мочевина, физиологически активные амины, антибиотики, кетоновые тела и др. | Стеклянные электроды, твердотельные электроды, ИСЭ, ИСЭ не основе полевых транзисторов, газочувствительный эл-д, ИСЭ на основе полимерных мембран с иммобилизированным активным веществом, бислойных липидныхз мембран, биосенсоры и др. |
| Амперометрия (вольтамперометрия и ее модификации) | NO, антиоксиданты, аскорбиновая кислота, ферменты, ДНК, интеркаляторы, антитела, возбудители болезней (вирусы), лекарственные соединения и др. | ХМЭ-сенсоры с иммобилизированными реагентами, в том числе с откликом на принципах полеклярного распознавания, ДНК-сенсоры, иммуносенсоры, биосенсоры, амперометрические сенсоры с СОМС, бислойными мембранами, реконструированными ферментами и др. |
| Амперометрия в сочетании с ВЭЖХ, ПХА, микродиализом и капиллярным электрофорезом (детекторы в потоке жидкости) | Нейропереносчики, катехоламины, компоненты плазмы крова, межклеточной жидкости и клеток в микрообъемах жидкости, лекарственные средства (вопросы фармакокинетики) | Ультрамикроэлектроды (металлические, угольно-волоконные, screen-printed), угольно-пастовые электроды, металлические и металлоксидные электроды с каталитическим откликом, электродная система жидкость/жидкость и др. |
| Хроноамперометрия | Гормоны, антибиотики, интеркаляторы, лекарственные соединения | Сенсоры на основе ХМЭ, СОМС, бислойные липидные мембраны и др. |
| Кулонометрия (кулонометрические детекторы) | Объекты фармации, нейропереносчики, антиоксиданты | Активные металлические электроды, инертные электроды+источник кулонометрического титранта |
Интерес представляет амперометрический сенсор на гемоглобин в цельной крови. Его быстрый отклик стабилен и воспроизводим и обусловлен окислением гемоглобина при фиксированном потенциале на стеглоуглеродном электроде, покрытом слоем полимера на основе метиловой сини. Этот полимер образуется на поверхности электрода при циклическом изменении потенциала в некотором диапазоне, зависящем от состава раствора.
Из последних достижений в конструировании электрохимических сенсоров можно отметить создание с использованием планарной технологии микросенсорных батарей на основе ИСЭ для определения концентраций ионов водорода и калия в кровотоке работающего сердца. Такие устойства могут найти применение в медицине, в частности при хирургическом вмешательстве в области миокарда.
В таблице в качестве примера дан перечень основных компонентов, определяемых методами электроанализа в объектах биомедицинского назначения и фармации, который в целом отражает структуру области биоэлектроники.
Интерес представляют электрохимические сенсоры на основе ДНК и их фрагментов. Отклик таких ДНК-сенсоров формируется по-разному. Если иммобилизирована однонитивая ДНК на поверхности электрода, то при введении в раствор она гибридизируется с комплиментарной нитью определяемого компонента и дает амперометрический отклик. Однонитивая ДНК может быть включена при этом либо в угольную пасту электрода, либо иммобилизированна на поверхности золотого электрода за счет самообразующихся слоев с помощью меркаптогексильного фрагмента. Вместо однонитивой ДНК в сенсорах используют их фиксированный фрагмент, т.е. последовательность оснований, или олигомер (20 или 40 оснований), полученный синтетически. Чтобы зафискировать событие взаимодействия олигомера с определяемым компонентом, на электроде закрепляют метку – чаще всего какой-нибудь комплекс металла ( руьений, кобальт, железо и т.д.) с органическим лигандом (димирил, фенантролин), восстанавливающийся на этом электроде. Ток этой реакции чувствителен к событию комплиментарного взаимодействия.