При исследовании тканей методом ЯМР их используют как в нативном, так и в экстрагированном состоянии. Но отбор биожидкостей проще осуществить, поэтому они используются чаще.
При анализе спектров любых биоматериалов возникает ряд общих проблем, решение которых требует специальных методов.
1. Подавление сигнала воды
Вода – это основа любой биожидкости. Ее сигналы всегда интенсивнее сигналов растворенных веществ. Для подавления сигнала воды можно использовать лиофилизацию, а затем растворить осадок в D2O. Но во время лиофилизации теряются летучие и нестабильные компоненты. Вследствие этого анализ теряет точность.
Чаще для подавления сигнала воды используют специальные импульсные последовательности. Одна из них – метод селективного предварительного насыщения. – на пробу воздействуют радиочастотными импульсами большой длительности, селективно настроенными на частоту сигнала воды. Разработаны и более сложные последовательности.
2. Пробоподготовка
К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D2O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил-[2,2,3,3-2Н4]-пропионат натрия.
На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений.
Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.
Для большинства измерений используют частоту ЯМР 500-700 МГц.
3. Методы обработки и интерпретации спектров
Спектр ЯМР любой биологической жидкости – это суперпозиция спектров огромного числа соединений, среди которых лишь несколько десятков представляют реальный интерес, так как только их присутствие или изменение и концентрации несет информацию, важную с точки зрения медицинской диагностики.
Полный анализ занимает много времени, не целесообразен, так как не выполняет основную задачу – быстро обнаружить аномалию и определить ее природу.
Для анализа спектров используется подход, основанный на сверке информации. Сначала отбирают группу «здоровых» людей (от нескольких десятков до нескольких сотен человек) и измеряют спектры взятых у них биологических жидкостей в строго стандартных условиях. Затем каждый спектр преобразуют в гистограмму. При этом количество данных значительно сокращается без существенной потери информации. Затем интегральные интенсивности сводят из гистограммы в таблицу по спектрам для всех измеренных образцов. Полученную матрицу данных обрабатывают с помощью стандартных методов статистического анализа. При анализе биологических жидкостей пациента достаточно определить, вписывается ли значение интенсивностей в средние показатели для здоровых людей.
Идентефикация каждого компонента может оказаться достаточно важной, особенно в случае, если его можно использовать в качестве биомаркера патологии.
В особых случаях может потребоваться предварительное разделение компонентов образца. Для этого чаще всего используют высокоэффективную жидкостную хроматографию или твердофазную экстракцию.
Для ЯМР анализа в основном используют плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость. Ниже приведена таблица, в которой перечислены патологии, которые можно определить при анализе той или иной жидкости.
Патологии, определяемые с помощью ЯМР
| Биологическая жидкость | Определяемые патологии |
| Моча | · Результат трансплантации почек (прижился орган или нет)· Выявление почечной дисфункции· Механизмы функционирования почек при отравлении ядами· Диагностика врожденных дефектов метаболизма у новорожденных· Изучение токсических эффектов от ксенобиотиков |
| Плазма крови | · Патологии в различных органах· Сахарный диабет· Онкологические заболевания (в т.ч. отличие доброкачественных и злокачественных опухолей на ранней стадии) |
| Цереброспинальная жидкость | · Рассеяный склероз· Болезнь Альцгеймера· Передозировка лекарственными препаратами· Бактериальный менингит· Сахарный диабет· Недостаточность витамина В12 |
Кроме перечисленных патологий возможно определение профилей метаболических заболеваний еще до того, как возникнут соответствующие симптомы, возможно выбрать диету и подходящий режим тренировок.
Главной проблемой в медицинском ЯМР анализе является интерпретация огромного количества получаемых данных, а также выявление взаимосвязи между патологией и изменением состава той или иной биологической жидкости.
Масс-спектрометрические методы в биомедицинских исследованиях
Масс-спектрометрия представляет собой метод исследования веществ, основанный на определении массы и относительного количества ионов, образованных из молекул, подвергнутых ионизации. Приборы, позволяющие получить масс-спектры, называются масс-спектрометрами.
Каждый масс-спектрометр независимо от деталей конструкции состоит из следующих основных элементов:
1) системы введения вещества в прибор;
2) источника ионов, предназначенного для получения ионов из анализируемых веществ;
3) масс-анализатора, предназначенного для разделения ионов2 по массам (вернее, по отношению массы к заряду);
4) детектора и регистрирующего устройства, предназначенного для регистрации количества образующихся ионов различной массы;
5) вакуумной системы, обеспечивающей необходимый вакуум в приборе.
Большие принципиальные возможности масс-спектрометрии появляются при сочетании её с другими методами. Сочетание методов значительно расширяет возможности каждого из них, позволяя получать больше информации об объекте исследования.
Весьма эффективными, как для хроматографии, так и для масс-спектрометрии, оказались хромато-масс-спектрометры – одни из наиболее распространенных современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предварительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измерение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому масс-спектрометры в хромато-масс-спектрометрах большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями, на короткое время поступающими в источник ионов.
Рассмотрим наиболее распространенные масс-спектрометрические методы.
1. Хромат -масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой
В индуктивно-связанной плазме ионы генерируются при атмосферном давлении, в то время как масс-спектрометр работает при давлении меньше чем 10-5 мБар. Между ИСП и МС используется интерфейс в виде «узкого горла», с помощью которого вытягиваются ионы из плазмы и осуществляется перепад давлений.
Этот метод позволяет определить элементный состав биоматериала.
Преимуществами этого метода являются:
· Многоэлементность
· Низкие пределы обнаружения
· Малое время анализа
· Малый объем анализируемой пробы
Недостатком является то, что спектральные и матричные влияния существенно повышают нижнюю границу определения содержания.
Метод используется для выявления нарушений микроэлементного статуса пациента путем анализа крови, мочи или волос и позволяет разработать дополнительные пути коррекции различных патологий, а также прогнозировать и предотвращать ряд осложнений.
2. Газовая хроматография-сжигание-масс-спектрометрия
Позволяет определить соотношение изотопов 13С\12С. Метод широко используется в спортивном допинг-контроле. Соотношение этих изотопов в организме человека лежит в пределах от -17‰ до -27‰. При употреблении допинг-препаратов, которые изготавливаются обычно из растительного сырья, соотношение меняется до -30‰.
Перед определением изотопного соотношения хроматографичеки отделяют гормоны и вещества, аналогичные гормонам. Затем проводят определение соотношения изотопов.
Основная проблема этого анализа – сложность матрицы и существенная разница концентраций целевых соединений.
Так как пробоподготовка в масс-спектрометрических методах сложная и многоэтапная, каждая проба сопровождается двумя контрольными: заведомо положительной и заведомо отрицательной.
Иммунохимические методы
В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела – это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в иммунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества – антигена.
Антиген – это вещество, которое индуцирует выработку антител.
Достоинства метода:
· Быстрота и простота определения;
· Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях;
· Не сложная пробоподготовка;
· Высокая точность;
· Не требуется дорогостоящей аппаратуры.
Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы.
Метод применяется для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов, определения биологически активных веществ.
Для определения моновалентных антигенов используется конкурентная схема – в систему водятся меченые ферментом вещества, которые конкурируют с антигеном при взаимодействии с ограниченным числом центров связывания специфичных антител.
Существует два способа реализации иммунохимического анализа – прямой и непрямой.