Методики анализа витаминов (стр. 1 из 3)
Методики анализа витаминов
Витамин А
(Мол. вес 299,22)
Являясь сильно ненасыщенным соединением, витамин А легко реагирует с кислородом воздуха и окисляющими агентами.
Наличие в молекуле спиртовой группы обусловливает реакции с хлорангидридами кислот с образованием производных — бензоат, ацетат и др. в-нафтойнокислый эфир представляет кристаллическое вещество, также обладающее витаминным действием.
Качественные реакции
1. Максимум абсорбции при 328 нм.
2. В хлороформном растворе с треххлористой сурьмой появляется синее окрашивание.
Количественное определение
Реакция с треххлористой сурьмой используется и для количественного определения. Синюю окраску сравнивают со стандартной шкалой так называемых синих единиц.
5—10 г драже экстрагируют хлороформом для извлечения витамина А, хлороформ отгоняют. Остаток омыляют 0,5 н. раствором спиртового раствора едкого кали в продолжение ½ часа. После этого из смеси извлекают неомыляемую фракцию серным эфиром 3—4 порциями (по 50—100 мл), соединенные эфирные вытяжки промывают водой, высушивают безводным сульфатом натрия, растворитель нацело удаляют выпариванием в токе углекислоты, остаток растворяют в хлороформе, чтобы в 1 мл раствора содержалось от 10 до 40 ИЕ витамина А.
К 0,2 мл хлороформного раствора добавляют 1 каплю уксусного ангидрида и 2 мл хлороформного раствора треххлористой сурьмы. Появляющуюся синюю окраску немедленно сравнивают с подходящей по цветности пробиркой стандартной шкалы или в ступенчатом фотометре, фотоколориметре и т. д.
При визуальном способе определения наиболее точные результаты получаются, если окраска по интенсивности укладывается в пределах 4—10-й пробирок.
Для приготовления шкалы пробирок-эталонов 75 г химически чистого сульфата меди и 3,5 г химически чистого нитрата кобальта растворяют в 500 мл воды. Полученный раствор разбавляют водой, как указано ниже.
Реакция витамина А с треххлористой сурьмой протекает быстро, достигая максимума приблизительно через 10 секунд; при низких температурах (0—1°) окраска более устойчива; яркий (дневной или искусственный) свет заметно влияет на быстроту выцветаемости.
Витамин В1(Тиамин-бромид бромистоводородный)
(Мол. вес 435,2)
1. Качественные реакции. При прибавлении к подкисленному разведенной азотной кислотой 1%-ному раствору нескольких капель раствора нитрата серебра выпадает творожистый осадок, не растворимый в азотной кислоте.
2. Тиохромная проба основана на переводе тиамина красной кровяной солью в щелочной среде в тиохром, растворимый в бутиловом или изоамиловом спирте с синей флуоресценцией:
К 5 мл раствора тиамина (с содержанием 0,01 мг) в делительной воронке добавляют 5 мл 1%-ного раствора красной кровяной соли, перемешивают и оставляют стоять в течение 2 минут. Затем добавляют 20 мл изобутилового спирта и сильно перемешивают, встряхивая в течение 1 минуты, отделяют спиртовый слой и фильтруют. Тиохром, полученный в результате окисления тиамина, обусловливает синюю флуоресценцию.
3. Тиамин дает осадки с некоторыми общими алкалоидными реактивами, например с реактивом Драгендорфа (пикриновая кислота не дает осадка).
Количественное определение
1. После нейтрализации (по бромтимоловому синему) тиамин-бромид определяется аргентометрически.
2. Другой метод основан на свойстве витамина В1 образовывать с диазотированным пара-амино-ацетофеноном соединение фиолетово-красного цвета, которое нерастворимо в воде, со многими органическими растворителями образует цветные растворы, допускающие сравнение с эталонными растворами. Из органических растворителей применяют обычно ксилол или толуол.
Для определения тиамина, растворенного в однородном бесцветном растворителе, нет необходимости извлекать цветное соединение из раствора. В этих случаях прибавляют изопропанол в количестве, достаточном для растворения цветного соединения, и проводят определение по стандартному раствору.
Для анализа берут такое количество препарата, в котором содержится 100 микрограммов (0,0001 г) тиамина. Эталон готовят растворением 50 мг витамина Вх (точная навеска) в 500 мл 50% по объему) этанола, содержащего 1 каплю 4 н. соляной кислоты. Хотя этот эталонный раствор можно сохранять при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, предпочитают все же готовить его на срок не более 1 месяца. Кроме эталонного раствора заготовляют: 1) 0,03%-ного раствора пара-амино-ацетофенона в 0,2 н. соляной кислоте; 2) 0,1%-ный раствор нитрита натрия; 3) 1 н. и 2,5 н. растворы едкого натра; 4) 50%-ный этанол (по объему); 5) толуол; 6) изопропанол и 7) 4 н. соляную кислоту.
Для приготовления реактива под названием диазораствор А в небольшой склянке смешивают 10 мл раствора пара-амино-ацетофенона и 2 мл раствора нитрита натрия и охлаждают не менее 2 минут в ледяной воде. Перед пользованием к смеси прибавляют 3 мл 1 н. раствора едкого натра и взбалтывают. Реактив под названием диазораствор Б готовят так же, как и раствор А, с той лишь разницей, что вместо 1 н. раствора едкого натра к раствору Б прибавляют 2,5 н. раствора едкого натра.
Испытуемый ампульный раствор смешивают с таким количеством перегнанной воды, чтобы каждый миллилитр смеси содержал около 100 микрограммов тиамина. В калиброванную пробирку на 10 мл вливают 1 мл смеси, прибавляют 2 мл 50%-ного этанола и помещают в водяную баню при температуре 60°. Через 1 минуту приливают 1 мл диазораствора А, сильно взбалтывают и снова оставляют в бане на 2—-3 минуты. Затем смесь охлаждают, прибавляют 1 каплю 4 н. соляной кислоты и изопропанол до метки, взбалтывают и сравнивают в колориметре с контрольным раствором, изготовляемым смешением 1 мл воды с 1 мл эталонного раствора тиамина, 1 мл 50% этанола и 1 мл диазораствора А по методу, описанному выше.
3. Для определения витамин В1 по другому методу растворяют 0,4—1,5 мг его в 10 мл воды, прибавляют 0,5 мл реактива с фосфорно-вольфраматом и 0,4—0,6 мл 10%-ного раствора едкого натра. Появляется синее окрашивание. Титруют 0,002 н. раствором красной кровяной соли, 1,82 мл которого соответствует 1 мг витамина В^ до исчезновения синего окрашивания.
Реактив готовят следующим образом: 10 г вольфрамата натрия растворяют в 75 мл воды, прибавляют 8 мл 85%-ной фосфорной кислоты и слабо нагревают в течение 2 часов. Если раствор зеленеет, прибавляют немного бромной воды после нагревания в течение указанного времени и избыток брома удаляют кипячением. По охлаждении доводят до 100 мл.
Витамин В2(Рибофлавин. Лактофлавин)
(Мол. вес 376,2)Качественные реакции
1. 0,001%-ный раствор (1 мг: 100) рибофлавина — бледного зеленовато-желтого цвета в проходящем свете с интенсивной желтовато-зеленой флуоресценцией, исчезающей от прибавления минеральных кислот или щелочей.
2. При восстановлении цинком в уксуснокислом или солянокислом растворе рибофлавин переходит в лейкофлавин, присоединяя 2 атома водорода.
Количественное определение
1. Непосредственно колориметрированием желтых растворов рибофлавина.
2. По азоту. К 0,3 г рибофлавина (точная навеска), предварительно высушенного в течение 18 часов в вакуум-эксикаторе над серной кислотой, в кьельдалевской колбе прибавляют 1 г бензойной кислоты и определяют содержание азота, разрушая смесь не менее 5 часов. Содержание азота должно быть не менее 14,5% и не более 15,2%.
Витамин В6(Пиридоксин. Адермин)
(Мол. вес 205,6)
Качественные реакции
1. С фосфорно-вольфрамовой кислотой адермин образует нерастворимое соединение (осадок).
2. С хлорным железом адермин дает красное окрашивание.
3. Смешивают 1 мл 0,01%-ного раствора с 1 мл 0,04%-ного раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида в абсолютном алкоголе и затем прибавляют 1 каплю раствора аммиака — появляется синее окрашивание.
Количественное определение
1. Колориметрическое определение основано на превращении четвертичного основания в фиолетового цвета соединение типа кар-бопиридинцианина, которое колориметрируют, сравнивая со стандартом.
2. Солянокислую соль адермина можно определять титрованием раствором щелочи при индикаторе бромтимоловом синем; для проверки оттитрованную жидкость вновь титруют 0,1 н. раствором нитрата серебра.
Фолиевая кислота(Птероилглутаминовая кислота)
(Мол. вес 441,21)Качественные реакции
1. Получение азокрасителя.
2. Спектр поглощения в ультрафиолете (при рН 11) имеет максимум при 255, 282 и 365 нм.
Количественное определение
При восстановлении фолиевой кислоты в солянокислом растворе цинковой пылью в числе других продуктов отщепляется пара-амино-бензойная кислота, которую диазотируют нитритом натрия. Полученная соль диазония сочетается с N-(1-нафтил)-этилендиаминди-гидрохлоридом в присутствии сульфамата аммония NH2SO2 ONH4
При этом наблюдается фиолетовая окраска раствора, интенсивность которой пропорциональна концентрации и измеряется в фотоколориметре или в спектрофотометре.
Требуются реактивы: 1) раствор желатины (1,5 г желатины и 0,1 г бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды), 2) 10%-ный раствор соляной кислоты, 3) 0,1%-ный раствор нитрита натрия, 4) 8%-ный раствор мочевины и 5) 0,1%-ный раствор N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида.
Точно 0,05 г пара-аминобензойной кислоты с температурой плавления 186—187° отвешивают в стаканчике емкостью 15—20 мл, растворяют в 96%-ном этиловом спирте, переливают в мерную колбу емкостью 50 мл, стаканчик промывают 3—4 раза спиртом (общее количество спирта 25 мл), раствор доводят водой до метки и перемешивают. Из этого раствора отбирают 1 мл в колбу емкостью 250 мл, прибавляют 175 мл воды, 45 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, 2,5 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают. В 1 мл раствора содержится 0,004 мг пара-аминобензойной кислоты.