Прочносвязанные полисахариды в клеточных стенках ксиланового типа (стр. 4 из 5)
7) Так еще три раза. Проверяем рН универсальной лакмусовой бумажкой.
8) Готовим раствор 4Н КОН и 3% борной кислоты: 44,888 гр. КОН и 6 гр. Н3ВО3 на 200 мл. дисцилированной воды.
9) Заливаем 100 мл раствора к ксилеме и отстаиваем 1 час, затем центрифугируем и выливаем надосадочную жидкость.
10) Промываем водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин. промываем до тех пор пока рН среды не будет нейтральным.
2.3 Растворение целлюлозы
Получение раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде
1) N, N-диметилацетамид (ДМА) сушили над молекулярными ситами 4А.
2) В колбу присыпали 8 гр. хлорида лития и нагревали в термостате до 1800 в течение 4–5 часов, затем охлаждали и приливали 100 мл. высушенного над молекулярным ситом ДМА.
3) Колбу закрывали стеклянной пробкой и раствор перемешивали на шейкере до растворения хлорида лития (оставляли на ночь).
Выделение прочно связанных полисахаридов из растворенной целлюлозы клеточной стенки ксилемы льна
1) 1 гр. «целлюлозы» суспензировали в 10 мл. воды 40–60 мин.
2) Отделяли на воронке Шота со вставленным нейлоновым фильтром.
3) Осадок промывали на фильтре ацетоном.
4) Выдерживали в ацетоне (10 мл., 60 мин.)
5) Осадок промывали на фильтре ДМА
6) Выдерживали в ДМА (10 мл., 40–60 мин.)
7) Оставляли на ночь в свежей порции ДМА
8) На воронке шота отделяли «целлюлозу»
9) Суспензировали ее в 100 мл раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде.
10) Колбу закрывали стеклянной пробкой и перемешивали до растворения целлюлозы на шейкере (1–2 дня).
11) Раствор целлюлозы по каплям добавляли к 100 мл. дисцилированной воды при перемешивание на магнитной мешалке. Раствор оставляли на ночь.
12) Отделяли выпавшую целлюлозу на воронке Шота с нейлоновым фильтром и промывали ее два – три раза дисцилированной водой (по 50 мл.) Получили Фильтрат 1
13) Фильтрат 1 Заливали в диалезный мешок 12 – 14 тысяч Дальтон.
14) Диалезный мешок клали в 3-х литровую банк с дисцилированной водой и ставили на магнитную мешалку, воду в банке меняли 4 раза.
15) На роторном испарителе концентрировали раствор.
16) Хроматографируем концентрированный раствор. Готовим 40 пробирок, моем их хромкой и сушим в сушильном шкафу при 1200С.
17) На хроматографе задаем программу (по каплям, 40 пробирок, в одну пробирку 40 капель ≈ 1,8 мл.)
18) В эпиндорф вливаем концентрированный раствор и центрифугируем 5 мин. при 6 000 об/мин.
19) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mMpH 5,5, разделение по молекулярным массам.
20) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм. (Смотри гафик1)
21)Выпавшую целлюлозу суспензировали в 50 мл 0,01 М растворе NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN3, содержавший 0,1 мл раствора целлюлазы и инкубировали в течение ночи.
22) Раствор фильтровали на воронке Шота и осадок заново суспезировали в новой порции раствора фермента. Мы получили фильтрат 2.
23) Фильтрат 2 обессоливали на колонке Sephadex G-25, элюент 0,02% NaN3. 0,005 гр. BlueDextran 2000 кД и 0,250 гр. СоCl2 растворяли в 5 мл дисцилированной воды и хроматографируем. BlueDextran 2000 кД начало 25 мл конец 30 мл. СоCl2 начало 60 мл. конец 73 мл.
24) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mMpH 5,5, разделение по молекулярным массам.
25) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм (Смотри график2).
2.4 Моносахаридный анализ
1) Фильтрат 1 и Фильтрат 2 обессоливаем на колонке SepharoseG250, элюент 10мМ пиридин и 10мМ уксусная кислота рН 4,5.
2) Высушиваем при 600С до полного отсутствия воды.
3) Добавляем 400 мл ТФУ (Трифторуксусная кислота), помещаем в сушильный шкаф на 1 час при температуре 1200С.
4) Затем опять сушим при 600С
5) Растворяем водой и определяем моносахаридный соcтав на Daionex(Данные моносахаридного состава смотри в таблице 1).
6) Мы объединили наши пробирки в следующие фракции до целлюлазной обработки: фракция 1 5–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–23; фракция 4 24–26; фракция 5 27–35.
Фракции после целлюлазной обработки: фракция 1 6–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–19; фракция 4 20–24; фракция 5 25–26; фракция 6 27–31.
Рисунок 1 – Распределение прочносвязанных полисахаридов во фракциях после растворения целлюлозы до ферментативной обработки.
Рисунок 2 – Распределение прочносвязанных полисахаридов после растворения после ферментативной обработки
Таблица 1. Моносахаридный состав во фракциях
| Рамноза | Арабиноза | Галактоза | Глюкоза | Ксилоза | Галактуроновая кислота | Глюкуроновая кислота | |
| Фракция 1, после целлюлазы | 49.290 | 33.680 | 68.173 | 7.624 | 5.855 | 254.246 | 1.166 |
| Фракция 2, после целлюлазы | 61.981 | 43.261 | 99.500 | 6.804 | 13.317 | 311.360 | 3.365 |
| Фракция 3, после целлюлазы | 25.478 | 17.145 | 79.425 | 6.605 | 31.317 | 161.033 | 10.089 |
| Фракция 4, после целлюлазы | 6.349 | 7.295 | 48.161 | 25.828 | 86.452 | 67.533 | 10.577 |
| Фракция 5, после целлюлазы | 4.020 | 14.716 | 40.078 | 40.401 | 210.336 | 3.171 | 5.546 |
| Фракция 6, после целлюлазы | 1.678 | 4.407 | 13.217 | 28.017 | 136.191 | 6.781 | 1.291 |
| Фракция 1, до целлюлазы | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.535 | 358.507 | 0 |
| Фракция 2, до целлюлазы | 0.556 | 0.481 | 2.689 | 5.364 | 1.107 | 0.476 | 0 |
| Фракция 3, до целлюлазы | 12.596 | 15.664 | 39.576 | 12.444 | 0 | 21.317 | 1.393 |
| Фракция 4, до целлюлазы | 20.762 | 24.131 | 54.572 | 11.218 | 54.753 | 67.032 | 2.955 |
| Фракция 5, до целлюлазы | 82.195 | 151.536 | 325.976 | 131.493 | 0 | 426.007 | 19.982 |
3. Результаты и их обсуждение
При подготовке ксилемы в первую очередь надо было остановить все процессы происходящие в ней поэтому фиксировали ее. Обработка ксилемы включала два основных этапов. Первое – механическое растирание на мельнице для того что бы получит муку, так как так лучше будет удаляться не прочно связанные вещества с целлюлозой и лучше растворяться. Второе – экстракция пектина и гемицеллюлозы с хелатирующими и щёлочными растворами.
Удаление пектиновых веществ с мы осуществили с помощью оксалата аммония, как известно пектиновые вещества связаны между собой ионами Са, а оксалат аммония является хелатирующим веществом которое связывается с ионами Са и пектиновые вещества отделяются от целлюлозы. Для удаление оксалата аммония и пектиновых веществ из нашей колбы мы центрифугируем их 3 раза с водой.
Обработка клеточной стенки ксилемы льна 4% NaOHпозволяла извлекать гемицеллюлозные вещества, которые не извлекаются оксалатом аммония, нужен более сильный раствор. Мы применяли 4% NaOH который высвобождает целлюлозу от гемицеллюлозных веществ. Затем мы снова удаляли щелочь и гемицеллюлозные вещества с помощью метода центрифугирования при этом проверяли рН универсальной лакмусовой бумажкой, промывали до нейтрального.
Выдерживание в воде «отчищенной» ксилемы необходимо для так называемой активации, без этого этапа целлюлоза не растворяется. Выдерживание в ацетоне и ДМА необходимо для полного удаления воды, так как при наличие воды целлюлоза выподает в осадок. Клеточную стенку волокна растворяли в » 8% растворе LiCl в ДМА, и заново осаждали целлюлозу путём добавления воды. Осаждение в воде необходимо для того что бы фермент полностью расщепил целлюлозу, если опустить этот этап то целлюлоза плохо будет подвергаться гидролизу. 8% раствор LiCl в ДМА мы используем так как они вместе являются хорошими растворителями целлюлозы и не реагируют с ней, к тому от них легко избавиться с помощью хроматографии. Раствор отделяли от целлюлозы (Фильтрат 1). Целлюлозу суспензировали в содержащем целлюлазу ацетатном буфере. В течение 1–2 суток фермент растворял осаждённую целлюлозу (Фильтрат 2). Мы получили раствор прочно связанных полисахаридов с целлюлозой. Далее с помощью ТФУ мы разрушаем все гликозидные связи и при высушивание весь ТФУ испаряется, и остаются мономеры сахаров. Dionex эта ионно-обменная хроматография, на ней мы и определяем моносахаридный состав, заранее вкалываются стандарты моносахоров по которым мы и опознаем конкретный моносахар.
В дальнейшем планируется провести ЯМР анализ и определить тип связующих гликанов.
Выводы
1. Отчистили клеточную стенку от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.
2. Получили раствор прочносвязанных с целлюлозой полисахаридов.
3. Разделили фракции по молекулярным массам.
4. Определили моносахаридный состав во фракциях.
Литература
1. Керне, А. Жизнь растений. / А. Керне // СПб.: Просвещение, – 1906. – Т. 2. – 838 с.
2. Полевой, В.В. Физиология растений. / В.В. Полевой // М.: Высшая школа, – 1989. – 464 с.
3. Brett, C.T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall / C.T. Brett // Int. Rev. Cytol. –2000. –V. 199. –P. 61–99.
4. Chivasa, S., Proteomic analysis of the Arabidopsis thaliana cell wall / S. Chivasa, B.K. Ndimba, W.J. Simon, D. Robertson, X.L. Yu, J.P. Knox, P. Bolwell, A.R. Slabas // Electrophoresis. – 2002. – V. 23. – P. 1754–1765.
5. Cosgrove, D.J. Group I allergens of grass pollen as cell wall-loosening agents / D.J. Cosgrove, P.A. Bedinger, D.M. Durachko // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –1997. –V. 94. –P. 6559–6564.
6. Delmer, D. Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study / D. Delmer // Plant Physiol. Plant Mol. Biol. –1999. –V. 50. –P. 245–276.
7. DeWitt, G. Comparative compositional analysis of walls with two different morphologies: archetypical versus transfer-cell-like / G. DeWitt, J. Richards, D. Mohnen, A.M. Jones / Protoplasma. – 1999. – V. 209. – №3/4. – P. 238–245.