Наконец, существуют галактоглюкоманнаны, остов которых устроен как глюкоманнан. При этом к некоторым остаткам маннозы присоединены боковые цепочки из одиночной a – (1®6) – галактозы (у С-6). Подобные полисахариды особенно распространенные в клеточной стенке голосеменных.
b – (1®3) – Глюкан (каллоза).Каллоза по химическому составу напоминает целлюлозу и является линейным гомополимером, состоящим из остатков глюкозы. Однако в образовани связи участвует не С-4, а С-3 атом, что приводит к совершенно иным свойствам молекулы. При классификации каллозу обычно объединяют с поперечно-связывающими гликанами, имея в виду, что ее молекула не содержит уроновых кислот, а значит, безусловно, не является пектиновым веществом. Однако правильнее, пожалуй, было бы выделить ее в особый класс полисахаридов клеточной стенки, поскольку она не участвует в образовани поперечных связей между микрофибриллами. Каллоза – своего рода «пожарный» полисахарид. Она образуется при поранении, при формировании срединной пластинки в ходе деления клетки; по-прежнему, обсуждается ее роль как промежуточного или запасного соединения.
Пектиновые вещества
Вся сеть микрофибрилл и связывающих их гликанов погружена в матрикс из пектиновых веществ. Слово «пектин» многим, наверное, знакомо в связи с мармеладом. Одна из статей в области изучения этих соединений так и называлась «Пектины – это не просто желе» (Jarvis, 1984). Пектиновые вещества – одни из самых сложных молекул биологического происхождения, которым приписывают разнообразные функции. Они были открыты в 1790 году, когда французский химик N. Vauquelin выделил из яблок вещество, образующее в водном растворе студень. Термин «пектин» (от греческого pektóV – свернувшийся) был введен в 1825 году H. Braconnot (Комиссаров, Спиридонов, 1998). Исторически сложилось деление пектиновых веществ на растворимые в воде (гидропектин) и нерастворимые – протопектин.
Непременным компонентом пектиновых веществ является галактуроновая кислота, следовательно, эти молекулы имеют заряд. Карбоксильные группы уроновых кислот могут экранироваться различными способами, например, ионами кальция или метиловыми группами, поэтому пектиновые вещества, являясь природными ионообменниками, могут создавать подвижную систему локального изменения рН, заряда и т.д. Это приводит к регулированию действия ферментов, локализованных в клеточной стенке. Кроме того, пектиновые вещества определяют пористость клеточной стенки. Обработкой клеточной стенки пектиназами (но не целлюлазами или протеиназами) можно вызвать увеличение размеров пор. Свободные карбоксильные группы уроновых кислот могут связывать Ca2+ и образовывать таким образом сшивки между молекулами пектиновых веществ. Считается, что пектиновые вещества являются гидрофильным наполнителем простанства между микрофибриллами целлюлозы и предотврашают их коллапс при падении тургорного давления (Jarvis, 1992).
В случае пектиновых веществ до сих пор неясно, что можно считать индивидуальным полимером. Например, существует мнение, что различные типы пектиновых веществ ковалентно связаны друг с другом (Mohnen, 1999; Vinckenetal., 2003). Тем не менее, на сегодняшний день общепринята классификация их как индивидуальных компонентов клеточных стенок.
Полигалактуроновая кислота.Основным компонентом пектиновых веществ является полигалактуроновая кислота – гомополимер из остатков галактуроновой кислоты, находящихся в пиранозной форме и связанных a – (1®4) – связью. Во многом благодаря наличию полигалактуроновой кислоты, клеточная стенка имеет отрицательный заряд и ведет себя как нерастворимый полианион (Nari et al., 1991). Степень полимеризации варьирует от 30 до 200. Соли полигалактуроновой кислоты называют пектатами.
Рамногалактуронан I. Рамногалактуронан I – гетерополимер, остов которого состоит из рамнозы и галактуроновой кислоты. Соотношение Рам: ГалК часто составляет 1:1 и тогда остов состоит из повторяющегося дисахарида (®4)-a-D-ГалКр – (1®2)-a-L-Рамр (1®). В других случаях соотношение может составлять 1:2 и более. Звенья рамнозы никогда не располагаются друг за другом, всгда перемежаясь остатками галактуроновой кислоты. К 20–80% остатков рамнозы могут быть присоединены различной длины (от 1 до 50 гликозильных остатков) цепочки арабиногалактанов, арабинанов и галактанов. Ветвление полисахарида происходит только в звене рамнозы (у С-4). Типы боковых цепочек рамногалактуронана в значительной степени определяют пористость клеточной стенки, ее заряд, рН и баланс ионов. Степень полимеризации рамногалактуронана I может сильно варьировать, обычно приводятся значения около 1000.
Рамногалактуронан II. Исходя из названия полисахарида, можно было бы предположить, что остов молекулы построен как в рамногалактуронане I – из чередующихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты, однако он устроен совсем по-другому. По разнообразию мономеров и типов связей между ними рамногалактуронан II – самый сложный их известных в живых организмах полисахаридов. Хотя степень полимеризации его всего около 60, общее число типов связей в этом небольшом полимере – 20.
Рамногалактуронан II содержит 12 различных моносахаридов, а именно галактуроновую кислоту (включая необычную, b-связанную, форму), рамнозу, арабинозу (в том числе, в необычной, пиранозной, форме), галактозу, фукозу, метилфукозу, метилксилозу, апиозу, глюкуроновую кислоту, редкую для клеточной стенки кетозу – кетодезоксиманнооктоновую кислоту, а также присутствующую только в рамногалактуронане II ацеровую кислоту (3-С-карбокси-5-дезокси-L-ксилоза) и глюкозу. Остов молекулы содержит всего 9 a – (1®4) – D-ГалКр звеньев, к С-2 и / или С-3 атомам которых присоединены боковые цепочки сложной структуры. Состав этих цепочек охарактеризован достаточно тщательно, однако порядок их расположения на остове молекулы неизвестен и указывается на схемах предположительно.
Содержание рамногалактуронана II в клеточных стенках составляет всего 0,2–3,6% от сухой массы клеточных стенок (Matsunagaetal. 2004), однако, учитывая его сравнительно небольшую молекулярную массу, число молекул этого полимера вполне сопоставимо с числом молекул самых распростаненных полисахаридов. Структура рамногалактуронана II исключительно консервативна и, несмотря на ее сложность, практически не отличается у разных организмов и в различных тканях.
Ксилогалактуронан. Апиогалактуронан.Значительно менее распространенными, чем обсуждавшиеся ранее пектиновые вещества, являются ксилогалактуронан и апиогалактуронан, которые описаны сравнительно недавно, встречаются лишь в некоторых растительных объектах и не считаются типичными. Эти полимеры родственны полигалактуроновой кислоте, которая составляет остов молекулы. Боковые цепочки состоят из одиночных остатков ксилозы или апиозы, присоединенных к С-3 галактуроновой кислоты. Частота ветвления варьирует от 25 до 75% (Scholsetal., 1995).
Арабинан, галактан. В растительных клеточных стенках присутствуют цепочки a-L – (1®5) – арабинана и b-D – (1®4) – галактана. И те, и другие могут быть линейными или разветвленными, однако боковые цепочки, если присутствуют, представлены, как правило, одиночными остатками того же сахара, что и остов. Дискуссионным остается вопрос, всегда ли они являются боковыми ответвлениями рамногалактуронана I, или могут быть «самостоятельными» соединениями. Это же справедливо в отношении арабиногалактана.
Арабиногалактан. В растительных клеточных стеках обнаруживают арабиногалактан двух типов. В первом из них галактозные звенья соединены по С-4, во втором – по С-3 или С-6. Арабиногалактан II типа входит также в состав протеогликанов клеточной стенки. Антитела на арабиногалактан II типа реагируют и с арабиногалактановыми белками, и с рамногалактуронаном I, свидетельствуя, что в состав этих сложных молекул могут входить одинаковые арабиногалактановые звенья.
Прочно связанные полисахариды
Типы первичной клеточной стенки.
Типы вторичной клеточной стенки
Клеточная стенка ксиланового типа
Клеточная стенка желатинозного типа
Характеристика клеточных стенок исследуемых объектов
Клеточная стенка клеток ксилемы льна
Клеточная стенка волокон кокоса
Клеточная стенка волокон банана
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы
2.1 Растительный материал
Лен (Linumusitatissimum) – лубоволокнистые культуры в которых формирование клеточных стенок проходит исключительно интенсивно, а стадии развития детально охарактеризованы (Горшкова и др., 2003;). Ксилема для анализа была взята ниже точки слома 5 см, растения собирали через месяц после посадки. Лен был выращен на открытом грунте. Ксилему от флоэмы отчищали вручную, старались максимально отчистить от флоэмы, поэтому этот процесс проводился дважды, а те участки, которые плохо поддавались отчистки просто отбрасывались.
Волокна банана.
Волокна кокоса.
2.2 Подготовка ксилемы льна к экспериментальной части
1) Фиксировали замороженную ксилему при 1000С тридцать минут.
2) Сушили 60 минут при 600С.
3) Измельчали ксилему на «мельнице».
Отчистка от непрочносвязынных пектиновых и гемицеллюлозных веществ
1) 2 гр. ксилемы заливаем 100 гр. 1% оксалата аммония.
2) Эту колбу с смесью кипятим на водяной бане 60 минут при 970С, при этом колба закрыта.
3) Охлаждаем колбу.
4) Эту смесь центрифугируем 10 мин на 4000 об/мин и сливаем надосадочную жидкость.
5) Еще раз заливаем 1% оксалатом аммония нашу смесь и кипятим на водяной бане 30 мин., также центрифугируем.
6) Вымываем оксалат аммония водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин.