Силикагель и его применение в высокоэффективной жидкостной хроматографии (стр. 5 из 6)

Для оценки селективности сорбента и эффективности колонки в целом используют основные параметры хроматографического разделения.

2.2 Основные параметры хроматографического разделения

Основными хроматографическими параметрами, характеризующими поведение вещества в колонке, являются время удерживания компонента смеси и удерживаемый объем. Время от момента ввода анализируемой пробы до регистрации максимума пика называют временем удерживания (элюирования) t_R. Время удерживания складывается из двух составляющих - времени пребывания вещества в подвижной t₀ и неподвижной t_s фазах [13]:

t_R.= t₀ + t_s. (2.1)

Значение t₀ фактически равно времени прохождения через колонку адсорбируемого компонента. Значение t_R не зависит от количества пробы, но зависит от природы вещества и сорбента, а также упаковки сорбента и может меняться от колонки к колонке. Поэтому для характеристики истинной удерживающей способности следует ввести исправленное время удерживания t′_R [13]:

t′_R = t_R - t₀. (2.2)

Для характеристики удерживания часто используют понятие удерживаемого объема V_R - объем подвижной фазы, который нужно пропустить через колонку с определенной скоростью, чтобы элюировать вещество [13]:

V_R = t_RF, (2.3)

где F – объемная скорость потока подвижной фазы, см³с^-1.

Объем для вымывания несорбируемого компонента (мертвый объем) выражается через t₀: V₀ = t₀F, и включает в себя объем колонки, не занятый сорбентом, объем коммуникаций от устройства ввода пробы до колонки и от колонки до детектора. Исправленный удерживаемый объем V′_R соответственно равен [13]:

V′_R = V_R - V₀. (2.4)

При постоянных условиях хроматографирования (скорость потока, давление, температура, состав фаз) значения t_R и V_R строго воспроизводимы и могут быть использованы для идентификации веществ.

Любой процесс распределения вещества между двумя фазами характеризуют коэффициентом распределения D. Величина D отношением c_s/c₀, где с_т и с₀ – концентрации вещества в подвижной и неподвижной фазах соответственно. Коэффициент распределения связан с хроматографическими параметрами.

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k' = m_н/m_п. Коэффициент емкости показывает, во сколько раз вещество дольше находится в неподвижной фазе, чем в подвижной. Величину k' вычисляют из экспериментальных данных по формуле [13]:

(2.5)

Важнейшим параметром хроматографического разделения является эффективность хроматографической колонки, количественной мерой которой служат высота Н, эквивалентная теоретической тарелке, и число теоретических тарелок N.

Теоретическая тарелка – это гипотетическая зона, высота которой соответствует достижению равновесия между двумя фазами. Чем больше теоретических тарелок в колонке, т.е. чем большее число раз устанавливается равновесие, тем эффективнее колонка. Число теоретических тарелок легко рассчитать непосредственно из хроматограммы, сравнивая ширину пика w и время пребывания t_R компонента в колонке [13]:

(2.6)

Определив N и зная длину колонки L, легко вычислить Н:

(2.7)

Эффективность хроматографической колонки также характеризует симметричность соответствующего пика: чем более симметричен пик, тем более эффективной является колонка. Численно симметричность выражают через коэффициент симметрии K_S, который может быть определен по формуле [13]:

, (2.8)

где b_0.05 – ширина пика на одной двадцатой высоты пика; А – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передней границей пика на одной двадцатой высоты пика.

Для оценки воспроизводимости хроматографического анализа используют относительное стандартное отклонение (RSD), характеризующее рассеяние результатов в выборочной совокупности [13]:

, (2.9)

где n – количество параллельных хроматограмм; х - содержание компонента в пробе, определенное путем расчета площади или высоты соответствующего пика на хроматограмме;

– среднее значение содержания компонента, рассчитанное на основании данных параллельных хроматограмм; s² – дисперсия полученных результатов.

Результаты хроматографического анализа считаются вероятными, если выполняются условия пригодности хроматографической системы [19]:

- число теоретических тарелок, рассчитанное по соответствующему пику, должно быть не менее требуемого значения;

- коэффициент разделения соответствующих пиков должен быть не менее требуемого значения;

- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для высоты или площади соответствующего пика, должно быть не более требуемого значения;

- коэффициент симметрии соответствующего пика должен быть в требуемых пределах.

2.3 Аппаратурное оформление эксперимента

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

На рис. 2.4 представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде присутствующих в любой хроматографической системе.

Рисунок 2.4. Блок-схема жидкостного хроматографа: 1 - сосуд для подвижной фазы; 2 - насос; 3 - инжектор; 4 - колонка; 5 - термостат; 6 - детектор; 7 - регистрирующая система

В качестве сосудов для подвижной фазы (1) чаще всего используют стеклянные бутылки вместимостью 0,7-1 л. Большое значение имеет тщательная дегазация подвижной фазы. Предпочтительнее выполнять эту операцию непосредственно в рассматриваемом сосуде, чтобы исключить переливание растворителя.

Современные насосы (2) для жидкостной хроматографии представляют собой прецизионные устройства, обеспечивающие постоянную подачу растворителя в колонку и способные создавать давления до нескольких десятков МПа. Конструкция насоса определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе.

Инжекторы (3) обеспечивают ввод проб от 0,1 мкл до нескольких миллилитров с высокой воспроизводимостью при давлениях до 30-50 МПа. Инжекторы должны работать при повышенных температурах и в среде активных растворителей и реагентов.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали длиной 10, 15, 25 см с внутренним диаметром 4-5,5 мм, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Постоянство температуры обеспечивается термостатом.

Повышение температуры разделения улучшает эффективность колонок в ОФ ВЭЖХ. Стабилизация температуры также повышает точность количественных определений, поэтому использование термостатов (5) весьма желательно, а иногда обязательно. В ВЭЖХ чаще всего применяют воздушные термостаты с интенсивным перемешиванием воздуха, в которых расположены теплообменник для подогрева растворителя, дозатор и колонки.

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются дифференциальные рефрактометры, измеряющие показатель преломления системы проба-элюент, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области - УФ-детекторы).

Регистрирующая система (7) в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером, который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором.

2.4 Методика проведения эксперимента

В экспериментальной части курсовой работы была поставлена задача подобрать опытным путем хроматографическую колонку на основе химически модифицированного силикагеля для методики количественного определения эналаприла малеата, а также сравнить эффективность хроматографического разделения в зависимости от используемого сорбента.

Структурная формула эналаприла приведена на рис. 2.5 [20].

Рисунок 2.5. Структурная формула эналаприла

Субстанция эналаприла малеата представляет собой белый кристаллический порошок, плохо растворимый в воде, растворимый в этаноле и метаноле. Эналаприла малеат является биологически активным веществом, применяемым в качестве лекарственного средства для лечения артериальных гипертензий и застойной сердечной недостаточности, а также в комплексной терапии инфаркта миокарда.

Оборудование:

- весы аналитические электронные Mettler Toledo AG204;

- ультразвуковой очиститель Elma T710DH;

- жидкостной хроматограф Agilent 1100, соединенный с персональным компьютером.

Материалы:

- колонка размером 4,6х250 мм, заполненная силикагелем цианосилильным для хроматографии [19], с размером частиц 5 мкм Waters RP-CN;