Нанесение растворов проводят либо микрошприцом, либо отградуированными капиллярами. Размер наносимого пятна не должен превышать 4 мм. Это связано с тем, что при большем размере пятна, происходит изменение формы под действием физических сил, да и границы разделенных компонентов могут перекрываться.
Нанесение на пластины исследуемых веществ не должны сопровождаться разрушением сорбента (что довольно сильно влияет на качество разделения), поэтому капля должна наноситься касанием иглы или капилляра о слой сорбента, а не надавливанием. На размер образующегося пятна влияет не только количества наносимого раствора, но и от полярности растворителя и его температуры кипения. Так при нанесении одного и того же вещества в различных растворителях, образовавшееся пятно в котором в качестве растворителя использовался метанол будет больше, чем пятно от раствора хлороформа. С другой стороны при подогреве подложки испарение растворителей будет интенсивнее и размер пятна также уменьшается.
Конечно, проще использовать при нанесении для подсушивания пятен фен, но только в том случае, когда есть полная уверенность, что наносимые вещества не будут окисляться под действием горячего воздуха. Расстояние между наносимыми пятнами должно быть около 2 см.
Иногда при хроматографировании на пластинках наблюдается краевой эффект, в результате чего пятна располагаются не на одной линии а имеют вид подковы, либо по диагонали. Для устранения этого эффекта каждое пятно можно "снабдить" своей дорожкой, отделив нанесенный образец от других путем удаления линии сорбента. Это лучше всего делать под линейку острым предметом (типа скальпеля) но осторожно, чтобы не удалить слишком много сорбента.
После нанесения исследуемых веществ на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителей, так как даже небольшое содержание растворителя в исследуемом веществе может повлиять на разделение и даже изменить состав хроматографической системы.
Удаление растворителей обычно проводят естественной сушкой пластин 5-10 мин, либо при нагревании феном или в сушильном шкафу. [3, 4]
Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей.
· Восходящая тонкослойная хроматография
· Нисходящая тонкослойная хроматография
· Горизонтальная тонкослойная хроматография
· Радиальная тонкослойная хроматография.
Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, т.е. фронт хроматографической системы движется снизу-вверх. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.
Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся хроматографическая система насыщает парами камеру по всему объему.
Некоторые хроматографические камеры имеют на дне разделение на две ванночки. Это усовершенствование позволяет не только уменьшить расход хроматографической системы (для получения необходимой высоты хроматогратографической системы требуется меньший объем) но и использовать дополнительную кювету для растворителя, увеличивающего давления насыщенных паров в камере.
Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" лини фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить действительное значение Rf уже не представляется возможным. [3]
Этот метод хроматографии основан на том, что фронт хроматографической системы опускается по пластинке в основном под действием сил тяжести, т.е. фронт подвижной фазы движется сверху вниз.
Для этого метода в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель, который стекает и происходит хроматографирование исследуемого образца.
К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования. Этот метод используется в основном в бумажной хроматографии. [3]
Этот метод наиболее сложен в аппаратурном оформлении но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону.
Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму.
К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает". [3]
Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.
Здесь приведены основные способы хроматографирования в тонкослойной хроматографии. Существует еще достаточно много способов хроматографирования, о которых мы поговорим в дальнейшем.
После процесса разделения исследуемых веществ, пластинки сушат. Это тоже немаловажный процесс, так как при наличии на пластинке даже следов растворителя, возможно получить неправильные результаты хроматографирования.
Если хроматографическая система имела в своем составе только легкокипящие компоненты, то достаточно естественной сушки в течении 3-5 минут. Если же в состав системы входят высококипящие жидкости (спирты, вода, органические кислоты и т.д.), сушку пластин нужно проводить не менее 10 мин или помещать пластинку в сушильный шкаф. [3, 4]
Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ. Если вещества являются окрашенными, то идентификация начинается с определения цвета разделенных веществ.
Но в большинстве случаев разделяемые вещества бесцветны и простое визуальное сравнение невозможно.
Для тонкослойной хроматографии существует несколько видов качественного анализа (идентификации) разделенных веществ:
· Визуальные методы и определение Rf разделенных веществ.
· Цветные реакции.
· Сравнение со свидетелями.
· Физико-химические методы идентификации.
Рассмотрим подробнее каждый вид качественного анализа в тонкослойной хроматографии. [3, 4]
Визуальные методы используются в основном, для определения местоположения пятен разделенных веществ на хроматографической пластинке. Для этого пластинку рассматривают как в видимом свете, так и используя ультрафиолетовый свет (в основном свет с длиной волны 366 и 254 нм). Это первый этап идентификации, на котором определяется качество подобранных условий и полученных результатов хроматографирования.
Так, определив качество хроматографирования (отсутствие "хвостов" разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильную форму и размеры, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д.) и признании пригодным проведенного разделения для дальнейшего исследования, определяют Rf выявленных пятен. [3]
Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров. Определение значения Rf проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя
Rf = L/L0
Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1. Однако в литературе нередко встречается такие показатели как hRf, RfЧ100, которые являются тем же Rf, но умноженными на 100, для того, чтобы не оперировать десятичными значениями.
На значение Rf не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя, однако во многих методиках описывается прохождение фронта на расстояние 10 см. Это используется только для облечения расчетов Rf.
На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования. Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества. Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!