В современных лабораториях анализ аминокислотного состава и определение простых осколков проводится с помощью специальных хроматографов — автоматических аминокислотных анализаторов.
Уникальная последовательность аминокислотных остатков в цепи, характерная для каждого белка, называется первичной структурой белка.
В отличие от углеводов первичная структура белков строго специфична для каждого вида организмов. Так, гормон инсулин, построенный из 51 остатка а-аминокислот в виде двух цепей, соединенных дисульфидными мостиками, имеет неодинаковый состав у различных видов животных. Трехчленные звенья в определенном месте цепи А молекулы инсулина содержат следующие аминокислотные остатки: у быка аланин—серии—валин; у свиньи трео-нин—серии—изолейцин; у лошади треонин—глицин—изолейцин; у овцы аланин—глицин—валин; у человека треонин—серии—изолейцин (на схеме 9 они отмечены звездочками). Различия наблюдаются также в С-концевом остатке В-цепи: в инсулине человека это остаток треонина, а в инсулине быка — остаток аланина.
Отдельные молекулы белка взаимодействуют друг с другом, образуя водородные связи, причем цепи «свертываются» в виде спиралей. В так называемых фибрилярных белках отдельные цепи более растянуты. В глобулярных белках упаковка цепей более компактна.
В кристаллическом виде получены только глобулярные белки; фибрилярные белки не способны кристаллизоваться. Кристаллы белков, растущие из растворов, содержат растворитель, который входит в структуру белка, так что удаление его вызывает потерю кристалличности.
Особенности скручивания цепей белковых молекул (взаимное положение фрагментов в пространстве) называются вторичной структурой белков.
Полипептидные цепи белков могут соединяться между собой с образованием амидных, дисульфидных, водородных и иных связей за счет боковых цепей аминокислот. В результате возникновения этих связей происходит закручивание спирали в клубок. Эти особенности строения белков называют третичной структурой.
Наиболее всесторонне исследован белок, придающий красную окраску тканям мышц, — миоглобин. Его молекулярная масса 17 000. Он содержит одну окрашивающую группу на молекулу. Последняя имеет вид глобулы.
Проблема синтеза белков имеет огромное практическое, теоретическое и философское значение.
Прежде чем синтезировать белки, необходимо было научиться получать более простые вещества, построенные по тому же принципу, что и белки, — полипептиды. Синтез полипептидов белков из большого числа-молекул аминокислот — очень сложная задача. Так, если требуется получить полипептид, состоящий, например, из 20 остатков аминокислот и на каждой стадии синтеза выход будет 90 %, то окончательный выход на исходное сырье будет 0,9020X 100 = 12%.
Простейшие полипептиды—кристаллические вещества, растворимые в воде и почти нерастворимые в спирте. Они дают биуретовую реакцию. Полипептиды, как и белки, играют важную роль в процессах жизнедеятельности и являются продуктами частичного гидролиза белков.
Синтез полипептидов осуществляется различными методами. Простейшие из них разработаны Э. Фишером и Абдергальденом в начале нашего века. В последнее время разработаны новые методы, позволяющие получать более сложные полипептиды.
Синтез полипептидов этими методами осуществляется в три стадии:
1. Получение аминокислот с защищенными амино- или карбоксильными группами.
2. Образование пептидной связи.
3. Избирательное отщепление защищающих групп.
Первая стадия. Временная защита аминных или карбоксильных групп позволяет соединять аминокислотные остатки в желаемой последовательности, а также лишает аминокислоты амфотерных свойств. Для дикарбоновых аминокислот необходима дополнительная защита второй карбоксильной группы, для диаминокислот — дополнительная защита аминогрупп, для аминокислот, содержащих сульфгидрильные группы, — защита этих групп. Защитные группы должны быть устойчивыми в условиях синтеза, и их введение не должно вызывать рацемизации аминокислот, Для обратимой защиты аминогрупп пригодны следующие группы.
Карбобензоксигруппа С6Н5—СН2—О—СО—, вводимая с помощью карбо-бензоксихлорида С6Н5—СН2—О—СО—СL и отщепляемая либо каталитическим гидрированием, либо бромистым аммонием в жидком аммиаке.
n-Толуолсульфонильная группа (тозильная) n-СН3—С6Н4—5О2—, вводимая с помощью п-толуолсульфхлорида СН3—С6Н4—5О2—СL и удаляемая действием смеси йодистого фосфония и иодистоводородной кислоты,
Трифенилметильная группа (С6Н5)3С—, вводимая с помощью трифенилхлор-метана (С6Н5)3С—СL и удаляемая каталитическим гидрированием.
трет-Бутоксикарбонильная (СН3)3С—О—СО—, вводимая с помощью карбо-трет-бутилазида (СН3)3С—О—СО—N3 и удаляемая с помощью бромистого водорода в уксусной кислоте.
Карбоксильные группы обратимо защищаются превращением в метиловые, /прет-бутиловые, этиловые, бензиловые, нитробензиловые эфиры, амиды и гид-разиды. Наиболее удобны трет-бутиловые эфиры, которые легко получить действием изобутилена под давлением в присутствии серной кислоты или переэтери-фикацией с трет-бутилацетатом и хлорной кислотой и расщепляются в очень мягких условиях, например при действии трифторуксусной кислоты.
Самым лучшим способом защиты сульфгидрильной группы является замещение ее водорода бензильной группой, которая легко отщепляется действием натрия в жидком аммиаке, Вторая и третья стадии. При синтезе высших полипептидов и белков применяются многие методы. Хорошо себя оправдал, например, карбодиимидный метод. Дициклогексилкарбодимид (I) прибавляют к концентрированному раствору компонентов. При взаимодействии его с защищенной по аминогруппе аминокислотой (II) образуется О-ацилированная дициклогексилмочевина (III), которая с исключительной легкостью взаимодействует с эфиром аминокислоты (IV), образуя производное дипептида (V). Трудно растворимая дициклогексилмочевина (VI) легко отделяется от пептида Защита аминогруппы может быть осуществлена реакцией с карбобензокси-хлоридом С6Н5СН2ОСОСL, получаемым из бензилового спирта и фосгена. Бензи-локси карбонильная группировка легко удается каталитическим гидрированйем.
Существуют автоматические устройства, синтезирующие полипептиды этим методом с заданной программирующим устройством последовательностью аминокислот. Синтез пептидов чрезвычайно трудоемок, так как необходимо после каждой стадии выделять и очищать продукт реакции. При этом неизбежны потери вещества. Для синтеза рибонуклеазы — белка, содержащего 124 аминокислотных остатка, необходимо провести 369 химических реакций, включающих 11 931 стадию. Если проводить такой синтез классическим путем, с выделением и очисткой вещества на каждой стадии, вещество будет полностью потеряно задолго до достижения заключительной стадии.
В настоящее время такие многостадийные синтезы проводят так называемым твердофазным способом, когда вещество, подлежащее последовательным превращениям, прикреплено к твердой подложке ковалентной связью. Это позволяет избежать потерь, так как очистка вещества после каждой очередной стадии синтеза достигается простой промывкой. На конечной стадии готовый продукт снимают с подложки расщеплением ковалентной связи. При таком способе все операции осуществляются автоматически,
Использование новых методов привело к значительным успехам в синтезе сложных полипептидов. Начиная с 1954 г. осуществлен синтез, ряда гормонов, представляющих собой сложные полипептиды. Так, например, синтезированы один из гормонов гипофиза — окситоцин (8 остатков аминокислот); гормон инсулин, построенный из нескольких полипептидных фрагментов, самый большой из которых содержит 30 аминокислотных остатков, фермент панкреатическая нуклеаза и ряд других.
В растениях белки синтезируются из неорганических соединений при воздействии энзимов, в организме животных — из аминокислот;
Последние поступают с пищей в виде растительных или животных белков. Только некоторые аминокислоты в организме животных синтезируются из кетокислот и аммиака или других аминокислот. Такие аминокислоты называются заменимыми (глицин, аланин, орнитин и др.).
Из простейших аминокислот незаменимыми являются валин, лейцин, лизин и др.
Потребляемые организмами животных белки обязательно должны содержать незаменимые аминокислоты, иначе белковая пища будет неполноценной: прекратится рост организма, и он может даже погибнуть. Неполноценными белками являются желатина (нет триптофана), зеин кукурузы (не содержит лизина) и др.
Организм может усваивать и свободные аминокислоты, вводимые с пищей[3].
Важнейшим компонентом питания являются белки. Белки представляют основу структурных элементов клетки и тканей. С белками связаны основные проявления жизни: обмен веществ, сокращения мышц, раздражимость нервов, способность к росту и размножению и даже высшая форма движения материи — мышление. Связывая значительные количества воды, белки образуют плотные коллоидные структуры, определяющие конфигурацию тела. Помимо структурных белков, к белковым веществам относятся гемоглобин — переносчик кислорода в крови, ферменты — важнейшие ускорители биохимических реакций, некоторые гормоны — тонкие регуляторы обменных процессов, нуклеопротеиды — вещества, в значительной степени определяющие направление синтеза белка в организме, являющиеся носителями наследственных свойств. Строение белков, каж дой клеточки и ткани организма отличается большим разнообразием и вместе с тем строгим постоянством. В то же время бесчисленное множество различных видов белков, с которыми мы встречаемся в животных и растительных организмах, построено всего лишь из 20 распространенных в природе аминокислот, сочетание которых в молекулах белка может обусловить их огромное разнообразие.