Оказавшись в газовой фазе, десорбированные заряженные молекулы затем электростатически направляются из MALDI устройства ионизации в масс-анализатор. Времяпролётные (TOF) масс-анализаторы часто используются для разделения ионов по отношению массы к заряду (m/z). Импульсная природа MALDI очень удобна для TOF анализаторов, т.к. начальный момент времени можно засекать как момент лазерного импульса.
Было разработано несколько теорий для объяснения десорбции посредством MALDI. Модель термических пиков предполагает, что выброс неповреждённых молекул обусловлен слабым колебательным взаимодействием между матрицей и аналитом, что минимизирует перенос колебательной энергии от матрицы к модам молекул аналита, тем самым минимизируя фрагментацию. Теория импульсного давления предполагает, что создаётся градиент давления, перпендикулярный поверхности, и десорбция больших молекул вызвана передачей импульса при их столкновениях с быстро движущимися молекулами матрицы. Обычно считается, что ионизация происходит посредством передачи протона или катионизации во время процесса десорбции.
Полезность MALDI для анализа биомолекул основана на её способности давать информацию о молекулярном весе неповреждённых молекул. Способность давать точную информацию может быть чрезвычайно важна для определения и характеристики белков. Например, белок часто может быть однозначно определён точным анализом масс составляющих его пептидов (полученных химическим или же ферментативным воздействием на образец).[4]
Приготовление образца и матрицы оказывает значительное влияние на качество масс-спектров MALDI белков и пептидов (рис. 1.15). Среди большого разнообразия известных методов приготовления наиболее часто употребляемым является метод высушенной капли. В этом случае насыщенный раствор матрицы смешивается с раствором аналита так, чтобы соотношение матрицы к аналиту было около 5000:1. Аликвота (0.5-2.0 мкл) такой смеси затем помещается на место образца, где затем высушивается. Ниже приведена методика такого приготовления:
· отобрать пипеткой 0.5 мкл образца на подложку;
· отобрать пипеткой 0.5 мкл матрицы на подложку;
· перемешать образец и матрицу втягиванием их в пипетку и выпусканием;
· позволить высохнуть на воздухе.
- Для пептидов, небольших белков и большинства других соединений: насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с 0.1% ТФА.
- Для белков и других тяжёлых молекул: насыщенный раствор синапиновой кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с добавлением 0.1% ТФА.
- Для гликопептидов/белков и маленьких соединений: насыщенный раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в 50:50 ацетонитрил:вода.
Рис. 1.15. Обычно используемые в MALDI матрицы и подложка для MALDI с показанным расположением матрицы. Одним из преимуществ MALDI является то, что множество образцов может быть подготовлено в одно и то же время, как видно по этой многообразцовой подложке.
Также образцы могут быть приготовлены последовательным способом. В тонкослойном методе сначала на цель наносится гомогенная «плёнка» матрицы, а затем туда добавляется образец, который абсорбируется ей. Этот метод даёт хорошую чувствительность, разрешающую способность и точность определения. Аналогично, в толстослойном методе нитроцеллюлоза (NC) используется как добавка к матрице. После образования единого слоя NC-матрица на цели добавляется образец. Этот метод приготовления предотвращает образования щелочных аддуктов и значительно увеличивает чувствительность определения, особенно для пептидов и белков, экстрагированных из гелей. Сэндвичевый метод – другой вариант в этой категории. Тонкий слой кристаллов матрицы приготовляется как в тонкослойном методе, затем последовательно добавляются капли (a) водного 0.1% ТФА, (b) образца и (c) матрицы.
DIOS – свободный от матрицы метод, который использует импульсную десорбцию/ионизацию на кремнии (рис. 1.16). Поверхности структурированного кремния, такого, как пористый кремний или кремниевое нановолокно являются УФ-поглощающими полупроводниками с большой площадью поверхности (сотни м2/см3). При применения в масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией, строение структурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул растворителя и аналита, а поглощение УФ даёт механизм для передачи энергии лазера аналиту. Такая удачная комбинация свойств позволяет DIOS быть применимым для большого разнообразия биомолекул, включая пептиды, углеводы и небольшие органические соединения различных типов. В отличие от других прямых безматричных методов десорбции DIOS позволяет проводить десорбцию/ионизацию с малым разложением аналита или вообще без него.
DIOS сильно связан с MALDI. Оборудование для DIOS-MS требует только незначительной настройки для использования в MALDI; чип просто закрепляется на обработанной MALDI-подложке и вставляется в масс-спектрометр. Та же длина волны лазера (337 НМ), обычно применяемая в MALDI, подходит и для DIOS. Хотя DIOS сравним с MALDI в отношении чувствительности, у него есть несколько преимуществ из-за отсутствия мешающей матрицы: низкий фон на малых диапазонах массы, такое же размещение водных образцов, упрощённая подготовка образцов. Вдобавок, компоновка в чипах легко адаптируется к автоматической подготовке образца, при которой лазер быстро обрабатывает чип, переходя от одного участка к другому. DIOS может, таким образом, ускорить и упростить крупные анализы соединений с низкой молекулярной массой, так же, как MALDI для макромолекул. Так как массы многих низкомолекулярных соединений могут быть легко измерены, DIOS-MS применим для анализа превращений малых молекул, как ферментативных, так и химических. [3]
Бомбардировка быстрыми атомами/ионами, или FAB – метод ионизации, схожий с MALDI, так как в нём используется матрица и пучок высокоэнергетических частиц для десорбции ионов с поверхности. Важно, однако, обозначить различия между MALDI и FAB. В MALDI, энергетический пучок представляет собой импульсный лазерный свет, в то время как FAB использует непрерывный пучок ионов. В MALDI матрица обычно твёрдая кристаллическая, а в FAB обычно использует жидкую матрицу. Также нужно отметить, что FAB примерно в 1000 раз менее чувствителен, нежели MALDI.
Бомбардировка быстрыми атомами – мягкий способ ионизации, который требуетпрямого введения зонда для подачи образца и пучок нейтральных атомов Xe или ионов Cs+ для распыления образца и матрицы с поверхности зонда для подачи. Обычно в FAB спектре обнаруживаются ионы матрицы, наряду с протонированными или катионизированными (например, M+Na+) молекулярными ионами аналита.
Матрица FAB. Способствующая процессам десорбции и ионизации, матрица FAB – нелетучая жидкость, которая служит, чтобы постоянно восполнять поверхность новым образцом по мере того, как он бомбардируется пучком ионов. Поглощая большую часть падающей энергии, матрица также минимизирует разложение образца из-за высокоэнергетических частиц образца.
Две наиболее часто употребляющихся матрицы для FAB – м-нитробензиловый спирт и глицерин.
Быстрые атомы или ионы сталкиваются с матрицей, вынуждая матрицу и аналит десорбироваться в газовую фазу. Образец может быть уже заряженным и только потом быть переведённым в газовую фазу, или же может стать заряженным в ходе десорбции посредством FAB посредством реакций с окружающими молекулами или ионами. Оказавшись в газовой фазе, заряженные молекулы могут быть электростатически перемещены в масс-анализатор. [1]
Электронная ионизация – один из наиболее важных способов ионизации для повседневных анализов малых гидрофобных термически стабильных молекул и до сих пор широко используется. Так как EI обычно даёт большое число фрагментарных ионов, это «жёсткий» способ ионизации. Однако, фрагментарная информация также может быть очень полезной. Например, используя базы данных, содержащие свыше 200000 масс-спектров электронной ионизации, возможно определить неизвестное соединение в течение нескольких секунд (конечно, если оно есть в базе данных). Эти базы данных, а также объём памяти и поисковые алгоритмы современных компьютеров позволяет быстро просматривать такие базы (как, например, база NIST), таким образом значительно облегчая идентификацию малых молекул.Устройство электронной ионизации прямолинейно (рис. 1.18). Образец должен поставляться в газообразной форме, что осуществляется «выкипанием» образца посредством термической десорбции или введением газа через капилляр. Капилляр часто является выходом капиллярной колонки прибора газовой хроматографии. В этом случае капиллярная колонка обеспечивает разделение (это также известно как газовая хромат-масс-спектрометрия – GC/MS). Десорбция твердых или жидких образцов производится нагреванием в вакууме масс-спектрометра. После перехода в газовую фазу соединения переносятся в устройство электронной ионизации, где электроны возбуждают молекулу, тем самым вызывая ионизацию отрывом электрона и фрагментацию.
