Спектрофотонетрия в УФ- и видимой областях—один из наиболее широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе.
Анализируемые ЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обуславливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.
Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называется спектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой. Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в ультрафиолетовой (190-380 нм) и видимой (380-780 мм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.
Слектрофотометрической константой является удельный показатель поглощении (Е1см1%) , который рассчитывают по формуле:
(1) Е1см1% = А/С * l
Удельный показатель поглощения E1см1% представляет собой величину оптической плотности раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора, измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандартному образцу величину Е1см1% и преобразовав эту формулу, можно рассчитать концентрацию анализируемого вещества с относительной погрешностью до ±2%.
Идентификацию ЛВ можно провести по Е1см1%, характеру спектральных кривых в различных растворителях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.(2)
Фотоколориметрия отличается от спектрофотометрического анализа тем, что анализируемое вещество с помощью какого-либо реагента переводят (количественно) в окрашенное соединение. Вначале получают окрашенные растворы, используя растворы стандартных образцов (ГСО или РСО). Измерение оптической плотности производят на фотоколориметрах. Затем строят калибровочный график зависимости интенсивности поглощения окрашенных растворов от концентрации, по которому рассчитывают содержание ЛВ в испытуемых образцах ЛВ или ЛФ.
Флуоресцентные методы основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете, обусловленной либо химической структурой самих органических веществ, либо продуктов их диссоциации, сольволиза, других превращений. Способностью флуоресцировать обладают обычно органические соединения с симметричной структурой молекул, в которых имеются сопряженные связи (нитро-, нитрозо-, азо-, амидные, карбонильные или карбоксильные группы).
Полярография — метод, основанный на измерении силы тока, возникающего на микроэлектроде, при электровосстановлении анализируемого вещества в растворе. Растворителем служит вода, или органические и смешанные растворители. Электролиз проводят в полярографической ячейке, состоящей из электролизера и двух микроэлектродов: ртутного капающего и внешнего насыщенного каломельного. При соблюдении идентичных условий измерений для идентификации используют величину потенциала полуволны, а для количественного определения — высоту волны (измерение предельного диффузного тока). Количественный анализ выполняют методами калибровочных кривых с использованием стандартных растворов и методом добавок.(1,2)
Газожидкостная хроматография (ГЖХ) основана на распределении компонентов смеси между газовой и жидкой или твердой фазами. Распределение происходит в результате многократных актов сорбции и десорбции анализируемых веществ, которые вводятся в поток газа-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку с сорбентом. Поэтому метод ГЖХ применим для анализа летучих веществ или веществ, которые могут быть переведены в газообразное состояние. Разделенные вещества элюируются из колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков, по которым можно идентифицировать или определять содержание каждого компонента смеси.
Газовый хроматограф включает в себя систему измерения и регулирования скорости потока газа-носителя, систему ввода пробы испытуемого образца, газохроматографическую колонку, систему термостатирования и контроля температуры в различных узлах прибора и систему детектирования, регистрации и обработки информации, полученной на приборе.
Подлинность ЛВ методом ГЖХ можно подтвердить либо с помошью свидетелей, либо методом относительных удерживаний, В первом случае доказательством идентичности служит совпадение времени удерживания вешества-свидетеля и одного из компонентов смеси ЛВ при хроматографировании каждого в отдельности в одинаковых условиях. Во втором случае вещество-свидетель добавляют к пробе, затем анализируют по рекомендуемой методике. Рассчитывают по формуле величину относительного удерживания, которая является постоянной для ЛВ в конкретных условиях. Количественный анализ выполняют в тех же условиях, используя для расчетов такие параметры, как площадь или высота пиков ЛВ. Площадь пиков устанавливают на хроматограмме с помощью планиметра, интегратора или умножением высоты пика на его полуширину.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от ГЖХ тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость, причем она проходит через колонку, наполненную сорбентом, с большой скоростью за счет значительного давления. Поэтому ВЭЖХ позволяет разделять многокомпонентные смеси на индивидуальные вещества высокой степени чистоты. ВЭЖХ отличается высокой чувствительностью {до 10 6 г). На разделение 10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин.
Жидкостный хроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Колонки изготавливают из нержавеющей стали, они имеют длину 10-25 см, внутренний диаметр 0,3-0,8 см и плотно набиваются адсорбентом с размером частиц 5-10 мкм. В качестве элюента используют различные углеводороды в сочетании с этанолом. Детектором обычно служит спектрофотометр с переменной длиной волны (190-900 нм), но существуют также флуориметрические. электрохимические и другие детекторы.
Подлинность испытуемых ЛВ подтверждают по времени выхода каждого компонента смеси из колонки, которое будет стабильно при одинаковых условиях проведения эксперимента. Количественное содержание рассчитывается по площади пика, которая пропорциональна количеству ЛВ в пробе.(2)
4. Методы выделения кумаринов
Для выделения кумаринов из растений обычно применяются различные растворители: этанол, метанол, бензол, хлороформ, диэтиловый и петролейный эфиры или их комбинации.
4.1. Наиболее полная экстракция кумаринов (в свободной форме и в форме гликозидов) достигается при использовании спирта этилового различных концентраций, как на холоду, так и при нагревании. Для очистки суммы кумаринов от сопутствующих веществ густой экстракт, полученный после отгонки экстрагента, обрабатывают хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром. При использовании в качестве экстрагента петролейного эфира хорошо извлекается смесь фурокумаринов, которые после концентрирования экстракта можно выделить в кристаллическом состоянии. В ряде случаев дополнительно проводится обработка экстракта активированным углем, кипящей водой с последующим сгущением и дальнейшим извлечением гидроксилированных и метоксилированных кумаринов хлороформом, этилацетатом и бутанолом, непосредственная обработка сухого остатка смесью хлороформа — этиловый спирт (97:3) (для выделения аналогичных производных) или же используется само спиртовое извлечение. Например, для извлечения суммы 7-гидроксилированных кумаринов из корней Helianthus annum L. предложено проводить последовательную экстракцию ацетоном, смесью ацетон — метанол (1:1) с последующим освобождением от пигментов в делительной воронке смесью гексан — эфир (6:4). Иногда целесообразно растительный материал обрабатывать петролейным эфиром, а затем исчерпывающе экстрагировать хлороформом или метанолом. Для выделения пеуцеданина применяют экстракцию метанолом в аппарате Сокслета, аналогичным способом с использованием последовательной экстракции семян Angelica archangelica L. н-гексаном, дихлорметаном и метанолом и последующей препаративной ТСХ были выделены шесть производных фурокумарина. Эти же экстрагенты позволяют получить сумму кумаринов и фурокумаринов из растения Metrodorea flavida. Для выделения гидрокси-, алкоксикумаринов и их гликозидов из семян Aesculus hippocastanum L. применяется экстракция 80 % этиловым спиртом с последующей обработкой горячей водой, фильтрованием и многократным извлечением веществ хлороформом, этилацетатом и бутанолом. Эскулин и фраксин из коры каштана получали путем экстракции из метанола. В гексановых и метанольных извлечениях из побегов Kielmeyera reticulata Saad., полученных последовательно, обнаружены 4-фенилкумарины и 4-н-пропилкумарины.
4.2. Для очистки кумаринов от сопутствующих веществ возможно использование метода омыления. Для выделения кумаринов проводят:
1. Экстракцию ЛРС органическим растворителем (эфиром) получают сумму кумаринов и балластных веществ.
2. Эфирный слой отделяют, отработанное сырьё выбрасывают.
3. Полученное эфирное извлечение обрабатывают 0,5% водным раствором КОН для очистки от фенолов и кислот.
4. Затем это же извлечение обрабатывают 10% спиртовым раствором КОН. Происходит разрыв лактонного кольца и образуются кумарины, которые переходят в водный слой. А в органическом растворителе остаются балластные вещества (смолы, стерины, спирты), органическую фазу выбрасывают.