Можно пробирку и не прокалывать, а иглу осторожно опустить сверху до дна пробирки и таким образом пофракционно отсасывать ее содержимое. В любом случае обнаружение разделенных зон осуществляется последовательной проверкой всех пробирок на ультрафиолетовое поглощение: на длине волны 280 тц для белков и 260 тц — для нуклеиновых кислот. Фракции, обнаружившие искомое содержимое, объединяются.
В качестве интересного для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, я выбрал исторические опыты Оказаки (1971 год), положившие основу современным представлениям о механизме редупликации ДНК. В этих опытах бактерии, растущие в жидкой питательной среде, получали через эту среду импульсную метку радиоактивным тимидином длительностью от 2 секунд до 2-х минут (в разных опытах). По окончании импульса бактерии быстро охлаждали, выделяли суммарную ДНК и центрифугировали ее в щелочном (для полной денатурации ДНК) градиенте 5-20% сахарозы в бакет-роторе на скорости 25 тыс. об/мин в течение 16 часов. После раскапывания градиента содержание новосинтезированной ДНК в каждой фракции оценивали по радиоактивности (в жидком сцинтилляторе — см. главу 15).
Далее происходит перераспределение метки между «свободными» (отделившимися в ходе выделения ДНК) фрагментами Оказаки и крупными фрагментами зрелой ДНК, лежащими в диапазоне 20—60 S. В эти последние преходит и часть радиоактивности, находившейся во фрагментах Оказаки, после их включения в состав комплементарной нити ДНК. Так что для кривых 5 и 6 относительная доля включения метки во фрагменты Оказаки и зрелую ДНК существенно изменяется.
Равновесное ультрацентрифугирование
Идея метода состоит в создании такого градиента по длине пробирки (в бакет-роторе), чтобы плотность среды центрифугирования у дна была больше, чем у наиболее плотных частиц, а у мениска — меньше, чем у наименее плотных. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут перемещаться вдоль градиента до тех пор, пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекращается, частицы различной плотности располагаются в разных участках градиента. Таким образом, осуществляется фракционирование частиц по их плотности.
Такое разделение имеет следующие особенности:
1. Размеры частиц и их массы не будут сказываться на окончательном распределении. Положение на градиенте будет определяться только плотностью частиц.
2. Движение частиц к положению равновесия будет происходить как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом наряду с седиментацией будет происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата на жидкость, заполняющую пробирку. Можно даже весь препарат смешать с полным объемом градиентной среды.
3. Процесс центрифугирования должен быть весьма длительным, так как при подходе к положению равновесия частицы будут двигаться очень медленно.
4. Вязкость среды в связи с этим является нежелательным фактором.
5. При равновесном ультрацентрифугировании возможна заметно большая загрузка препаратом, чем при зонально-скоростном центрифугировании.
6. В области равновесия частицы расположатся в виде полосы, ширина которой определится соотношением двух процессов:
концентрирования за счет седиментации — флотации и тепловой диффузии частиц. Эта ширина будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды и чем больше масса частиц — увеличение массы уменьшает склонность к диффузии. Распределение концентрации вещества в полосе описывается симметричной (гауссовской) кривой. По ее ширине, зная координату центра полосы (Гд), угловую скорость вращения и крутизну градиента плотности среды в центре полосы (dp/dr) можно рассчитать массу (сольватиро-ванной) частицы.
Сахароза непригодна для создания градиента при равновесном центрифугировании. Как видно из таблицы, приведенной в предыдущем параграфе, плотность даже 30%-ного раствора сахарозы намного меньше, чем у основных биологических объектов, в то время, как вязкость уже возрастает «катастрофически».
Можно ожидать, что подходящей средой для равновесного центрифугирования будет концентрированный раствор соли какого-либо тяжелого металла. Плотность такого раствора может оказаться весьма значительной, в то время как вязкость солевого раствора слабо зависит от его концентрации. Как показал опыт, наиболее удобными средами для равновесного ультрацентрифугирования оказались концентрированные растворы хлористого или сернокислого цезия (CsCI). В нижеследующей таблице приведены значения плотности растворов CsCI различной весовой концентрации:
| Конц.СsС1(%) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 65 (насыщ.) |
| р г/см3 | 1,079 | 1,174 | 1,286 | 1,420 | 1,582 | 1,785 | 1,910 |
Рассматривая эту таблицу, полезно вспомнить зависимость плавучей плотности биологических молекул от присоединения воды и ионов. Там была указана величина плавучей плотности ДНК в концентрированном растворе CsCI — 1,7 г/см3. таким образом различные по плотности молекулы ДНК, очевидно, можно фракционировать равновесным ультрацентрифугированием в градиенте CsCI. Чего нельзя сказать о РНК, плавучая плотность которой в этих условиях достигает величины >1,9 г/см3. Белки же, напротив, успешно могут разделяться в описываемых условиях. Для них плавучая плотность в концентрированных растворах CsCI колеблется в пределах 1,3-1,33 г/см3.
Литература
1 Давиденкова Е.Ф., Либерман И.С., Шафран М.Г. Генетические и патогенетические механизмы атеросклероза. // Клинич. медицина.-1990.- N 10.-С.-23.
2 Денисенко А.Д., Полесский В.А., Лозовский В.Т. Липопротеиды высокой плотности и атеросклероз. // Материалы I-го сов. - америк. симпозиума. - М.: Медицина, -1983.-С.113-122.
3 Дея К., Деккер М. Липопротеиды высокой плотности. - М.: Медицина,-1981.