Эксклюзионная хроматография (стр. 1 из 3)
Эксклюзионная хроматография
Основные понятия
Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами.
В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно.
Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс – от 102 до 108, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров.
По традиции процесс, проводимый в органических растворителях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах – гель-фильтрационной хроматографией. Принят единый термин, который происходит от английского «Size Exclusion» – исключение по размеру – и в наиболее полной степени отражает механизм процесса.
Детальный разбор существующих представлений о весьма сложной теории процесса эксклюзионной хроматографии проведен в монографиях. Мы рассмотрим только принципиальные основы метода, достаточные для практической работы.
Объем эксклюзионной колонки можно выразить суммой трех слагаемых:
Vс=Vо+Vi+Vd,
где Vо – мертвый объем – объем растворителя между частицами сорбента (объем подвижной фазы); Vi– объем пор, занятый растворителем (объем неподвижной фазы); Vd– объем матрицы сорбента без учета пор.
Полный объем растворителя в колонке Vt (его часто называют полным объемом колонки, так как Vd не принимает участия в хроматографическом процессе) представляет собой суммy объемов подвижной и неподвижной фаз:
Vt=Vо+Vi.
Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит от соотношения размеров молекул и пор, что схематически показано на рис. 2.15. Коэффициент распределения Kd, как и в других вариантах хроматографии, представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах:
Кd = Сi / Со.
Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то Kd вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми малыми размерами (в том числе и молекул растворителя), которые проникают во все поры (см. рис. 2.15) и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворителя Vt.
Рис. 1. Модель разделения молекул по размеру в эксклюзионной храматографии
Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвижной фазы Vo. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.
Молекулы промежуточного размера, способные проникать только в какую-то часть пор, удерживаются в колонке в соответствии с их размером. Коэффициент распределения этих молекул изменяется в пределах от нуля до единицы и характеризует долю объема пор, доступных для молекул данного размера. Их удерживаемый объем определяется суммой Vo и доступной части объема пор:
VR=Vo+KdVi.
Отсюда следует еще одно существенное отличие эксклюзионной хроматографии: в данном методе разделение заканчивается до выхода пика растворителя, в то время как в других вариантах ВЭЖХ компоненты смеси элюируются после пика растворителя.
Параметр k' в эксклюзионной хроматографии обычно не используют. Его можно выразить уравнением
k' = KdVi / Vo.
Для большинства современных сорбентов Vi ≈ Vo, поэтому k' ≈ Kd.
Связь между удерживаемым объемом и молекулярной массой (или размером молекул) образца описывается калибровочной кривой (рис. 2.16). Каждый сорбент характеризуется своей калибровочной кривой, по которой легко оценить область разделяемых на нем молекулярных масс. Точка А соответствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки Vo. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом Vo. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем Vi=Vt-Vo часто называют рабочим объемом колонки. Отрезок CD представляет собой линейный участок калибровочной кривой, построенной в координатах VR–IgM. Этот участок описывается уравнением
Vr = C1 – C2lgM,
где C1 – отрезок, отсекаемый на оси ординат продолжением отрезка СD, C2 – тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат.
Величину С2 называют разделительной емкостью колонки; ее выражают числом миллилитров растворителя, приходящегося на один порядок изменения молекулярной массы. Чем больше разделительная емкость, тем селективнее разделение в данном диапазоне масс. В нелинейных областях калибровочной кривой (участки АС и BD) в связи с уменьшением С2 эффективность фракционирования заметно снижается. Кроме того, нелинейная связь между IgM и Vr существенно усложняет обработку данных и снижает точность результатов. Поэтому всегда нужно стремиться выбирать колонку (или набор колонок) так, чтобы разделение анализируемого полимера протекало в пределах линейного участка калибровочной кривой.
Если какое-либо вещество элюируется с удерживаемым объемом больше Vt, то это указывает на проявление других механизмов разделения (чаще всего адсорбционного). Адсорбционные эффекты обычно проявляются на жестких сорбентах, но иногда наблюдаются и на полужестких гелях, видимо, из-за повышенного сродства к матрице геля. Примером может служить адсорбция ароматических соединений на стирол-дивинилбензольных гелях.
Рис. 2. Калибровочная кривая
Советские исследователи предложили теорию единого механизма жидкостной хроматографии полимеров на жестких гелях, из которой следует, что изменением параметров взаимодействия в системе полимер – сорбент – растворитель можно переходить от адсорбционного механизма к эксклюзионному и наоборот. В общем случае в эксклюзионной хроматографии нужно стремиться полностью подавить адсорбционные и другие побочные эффекты, так как они, особенно при исследовании молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров, могут существенно исказить результаты анализа.
Принципиальными отличиями эксклюзионной хроматографии от других вариантов являются заранее известная продолжительность анализа в конкретной используемой системе, возможность предсказания порядка элюирования компонентов по размеру их молекул, примерно одинаковая ширина пиков во всем диапазоне селективного разделения и уверенность в выходе всех компонентов пробы за достаточно короткий промежуток времени, соответствующий объему Vt. Хотя данный метод применяют, главным образом, для исследования ММР полимеров и анализа макромолекул биологического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.), указанные особенности делают его чрезвычайно перспективным для анализа низкомолекулярных примесей в полимерах и предварительного разделения проб неизвестного состава. Получаемая при этом информация существенно облегчает выбор наилучшего варианта ВЭЖХ для анализа данной пробы. Кроме того, микропрепаративное эксклюзионное разделение часто используют в качестве первого этапа при разделении сложных смесей путем комбинации различных видов ВЭЖХ.
Ограниченный диапазон коэффициентов распределения определяет и главный недостаток эксклюзионной хроматографии – заметно меньшее, чем в других вариантах ВЭЖХ, число пиков, которые могут быть полностью разделены на колонке заданной эффективности. Однако в последнее время благодаря успехам достигнутым в технологии изготовления высокоэффективных колонок, этот метод все шире применяют и для разделения малых молекул.
Особенности аппаратуры
Аппаратура для эксклюзионной хроматографии принципиально ничем не отличается от той, которую используют в других видах ВЭЖХ. Эксклюзионное разделение можно осуществить на любом жидкостном хроматографе, установив в него соответствующие колонки. Характеристики аппаратуры влияют главным образом на точность получаемых результатов. Специфичными для данного метода являются только некоторые детекторы и особые требования к системам обработки данных.
Из всех вариантов ВЭЖХ в эксклюзионной хроматографии полимеров предъявляются наиболее жесткие требования к стабильности потока подвижной фазы. Поэтому нужно использовать насосные системы с точностью подачи не хуже 0,3–0,5%. В лучших насосах, разработанных специально для данного метода, нестабильность скорости потока снижена до 0,1%.
Между дозатором и колонками весьма желательно устанавливать фильтр с минимальным мертвым объемом, так как забивание входного фильтра колонки при анализе полимеров происходит гораздо чаще, чем в других видах ВЭЖХ.
Точность результатов в экоклюзионной хроматографии полимеров заметно зависит от температуры. При ее изменении на 10 °С ошибка определения средних молекулярных масс превышает ±10% [23]. Поэтому в данном варианте ВЭЖХ термостатирование разделительной системы обязательно.
Дозатор и колонки обычно размещают в одном термостате. Как правило, достаточна точность поддержания температуры ±1 °С в пределах до 80–100 °С. В некоторых случаях, например, при анализе полиэтилена и полипропилена, рабочая температура составляет 135–150 °С. Необходимо также принимать меры для предотвращения заметных изменений температуры в линии, соединяющей колонку с детектором. При рабочих температурах до 40–50 °С и длине линии 5–8 см ее целесообразно изготавливать из фторопластового капилляра с наружным диаметром около 1,5 мм, внутренним – 0,3 мм. При более высоких температурах требуется термостатирование капилляра.