Другие растворители для ГВЭЖХ должны быть квалификации «для УФ-спектроскопии» или «для жидкостной хроматографии». Производство ацетонитрила и метанола, а также воды таких квалификаций освоено нашей промышленностью. При хранении, а также использовании таких растворителей всегда следует помнить о потенциальных загрязнителях и по мере возможности избегать их.
Примеси, находящиеся в метаноле или ацетонитриле, точно так же могут накапливаться на колонке и проявляться в виде пиков при градиенте. Это легко понять, если представить себе, что начальный состав растворителя органический компонент – вода 50: 50. Невымываемая таким растворителем примесь, например нафталин, может быть добавлена как в воду, так и в метанол и будет накапливаться в начале колонки одинаково независимо от компонента системы растворителей, ее содержащего (метанола или воды). Если спустя какое-то время начать градиентное элюирование, нафталин при более сильном растворителе начнет двигаться и выйдет в виде узкого пика.
Наиболее жесткие требования предъявляют к растворителю если градиент осуществляется с детектированием при длинах волн ниже 220 или 210 нм, так как в этом случае поглощают и проявляются в виде пиков многие примеси, УФ-прозрачные при 254 или 280 нм.
Единственным путем установления пригодности растворителей для ГВЭЖХ служит проверка в реальных хроматографических условиях с градиентом требуемого состава, но без введения пробы вещества (холостой градиент). Как правило, проверку проводят сначала на более грубых шкалах детектора и при длинах волн 254 или 280 нм, а при получении положительного результата переходят на более чувствительные шкалы и длины волн 220 нм и ниже. Если работа по ГВЭЖХ прервана на относительно большой срок (более недели) или один из растворителей (или оба) заменены на новые (даже той же квалификации и партии), всегда следует до начала работы с образцами создать холостой градиент для проверки работоспособности системы в целом.
Следует отметить, что многие добавки к растворителям, такие, как соли, кислоты, ион-парные и другие реагенты, способны заметно изменить свойства растворителей. Так, накопление полифосфатов в солях фосфорной кислоты, используемых для приготовления буферных растворов, приводит к существенному дрейфу при градиенте из-за сильного УФ-поглощения полифосфатов. В некоторых случаях удается уменьшить дрейф в градиентном режиме, если уравнять УФ-поглощение слабого и сильного
элюирующих растворов добавкой УФ-поглотителя, такого, как ацетон, к менее УФ-поглощающему раствору. Градиент тем легче осуществить, чем он меньше по диапазону, поэтому целесообразно менять растворитель по составу только в тех пределах, которые необходимы для разделения. Это позволяет повысить чувствительность, уменьшить дрейф нулевой линии и количество ложных пиков, а также ускорить как элюирование, так и возврат системы к исходным условиям для нового анализа.
Если при градиентном элюировании используют другой тип детектора, например флюориметрический, высокие требования к чистоте растворителей остаются, но меняется их направленность – не должно быть флюоресцирующих примесей. О пригодности растворителей для работы судят также, осуществляя холостой градиент.
В заключение отметим, что к градиентному элюированию следует прибегать только в тех случаях, когда его применение является единственным путем решения данной проблемы. Если проверка в градиентном режиме показала, что возможно использовать изократический вариант для интересующих. веществ, следует немедленно перейти к нему. Это всегда выгодно, даже в тех случаях, когда анализ разбивается на два изократичеоких, выполняемых на двух приборах с более сильным и более слабым растворителями. Более воспроизводимые результаты и возможность использовать более чувствительные шкалы, менее жесткие требования к качеству растворителя – это только некоторые из получаемых преимуществ.
Следует также отметить, что при работе в обращенно-фазном режиме с системой метанол – вода, вязкость которой не аддитивна, а меняется от 1 до 1,5 и затем до 0,6 Мпа•с при переходе от 100% воды к 100% метанола, колонка находится в неблагоприятных условиях, так как при постоянном расходе давление на колонку сначала возрастает в 1,5 раза, а затем падает в 2 раза к концу градиентного элюирования. Картина повторяется в процессе регенерации колонки, при возврате к слабому растворителю. Это сокращает срок службы колонки и затрудняет работу с колонками, содержащими мелкий сорбент (менее 5 мкм).
Литература
1. Barth H.G./J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 9, p. 409–429.
2. Беленький Б.Г., Мальцев В.Г. // В кн.: Прикладная хроматография. М., Наука, 1984, с. 54–64.
3. Энтелис С.Г., Евреинов В.В., Кузаев А.И. Реакционноспособные оли-гомеры. М, Химия, 1985.
4. Janca J., Kleparnik K./J. Liquid Chromatogr., 1982, v. 5, No. 2, p. 193 – 216.
5. Chamberlin T.A., Tulnstra H.E./Anal Chem., 1983, v. 55, No. 3, p. 428 – 432.
6. Shulz W.W./J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 7, p. 941–952.
7. Neff B.L., Overton J.R./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 8, p. 1537–1544.
8. Mori S., Suzuki M./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 9, p. 1841–1850.
9. Нефедов П.П. Канд. дис. Л., ИВС АН СССР, 1973. 150 с.
10. Виленчик Л. 3., Курбенин О.И., Беленький Б. Л / Высокомол. соед., 1984, т. А26, №10, с. 2223–2226.
11. Grubisic Z., Rempp R., Benoit Я./J. Polym. Sci., 1967, v. B5, No. 9, p. 753.
12. Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М., Наука, 1978. 328 с.
13. Samay G /Ada chim. Acad. sci. Hung., 1979, v. 102, No. 2, p. 157–164.
14.Dawkins J.F./Steric Exclusion Liquid Chromatography of Polymers. Chromatogr. Sci., 1984, v. 25, p. 53–116.
15.Kubin M./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 1, p. 41–68.