Смеси поверхностно-активных веществ и белков (стр. 2 из 2)
Рис. 4. Изотерма связывания бычьим сывороточным альбумином додецилсульфата натрия и октилбензолсульфоната натрия. Связывание выражено числом молекул ПАВ на молекулу белка. Белые символы отвечают 10-2MNaCl, черные —KT1MNaCl
Рис. 5. а — Изотермы связывания додецилсульфата натрия бычьим сывороточным альбумином при различных рН: 3.8, 4.1, 4.8, 5.6 и 6.8.. б — Изотерма связывания додецилсульфата натрия лизоцимом и осаждение белка из смешанного раствора в зависимости от концентрации додецилсульфата натрия
Высокая вязкость растворов смесей ПАВ и белков
Добавление ПАВ к растворам желатина при высоких концентрациях белка приводит к заметному увеличению вязкости, причем на зависимости вязкости от концентрации ПАВ регистрируется максимум. Аналогичные данные имеются и для смешанных растворов глобулярных белков и ионных ПАВ. Такое поведение подобно поведению смешанных растворов ПАВ и гидрофобизированных водорастворимых полимеров. Это согласуется с дифильной природой белка. Изменения вязкости связаны с образованием мицеллоподобных агрегатов, «сшивающих» молекулы белка.
Другое проявление дифильного характера белков обнаруживается при добавлении белка к раствору гидрофобизированного полимера. При добавлении лизоцима к раствору гидрофобизированного полиакрилата происходит значительное увеличение вязкости, однако при более высоких концентрациях белка вязкость понижается до исходного значения. Это очень похоже на эффект мицеллярных ПАВ при введении их в растворы полимеров. Причина в структурном сходстве глобул белка и мицелл ПАВ: наличие гидрофобного ядра и гидрофильной поверхности.
Фазовое разделение растворов смесей ПАВ-белок
Осаждение положительно заряженного белка при связывании анионных ПАВ — обычное свойство таких систем; при более высоких концентрациях ПАВ вновь происходит растворение осадка. Здесь опять проявляется общность свойств смешанных растворов ПАВ-белок с растворами смесей заряженных полимеров и противоположно заряженных ПАВ с той лишь разницей, что пары белок-ПАВ ведут себя намного сложнее. В этом можно убедиться на примере смесей растворов лизоцима и додецилсульфата натрия.
Рис. 6. Относительная вязкость растворов желатина в зависимости от концентрации добавленного додецилсульфата натрия; концентрация желатина: 0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 и 100 мас.%
Рис. 7. Зависимость вязкости 1%-ных растворов полиакрилата и гидрофобизированного полиакрилата от концентрации лизоцима в смеси.
При введении в раствор лизоцима небольших добавок ДСН образуется нейтральный комплекс в виде твердого вещества, находящийся в равновесии с избытком белка в растворе. Количество осажденного белка достигает максимального значения, когда связывание ДСН лизоцимом становится равным 8 молекулам ДСН на одну молекулу белка, т.е. точно равным числу положительных зарядов в молекуле лизоцима. При значительном избытке ПАВ осадок растворяется. Чем короче алкильные цепи ПАВ, тем больше должна быть его концентрация для растворения осадка. Растворение осадка отвечает кооперативной части изотермы связывания в условиях, когда концентрация свободного ПАВ достигает KKM.
Чем ниже концентрация ПАВ, приводящая к осаждению комплекса, тем ниже содержание воды в осадке, и в этом случае стехиометрия комплекса определяется глобулярной природой белка. Уникальная третичная структура нативного белка контролирует образование комплексов определенного состава. Поэтому содержание воды в осадке, образованном жесткими частицами, невелико, тогда как в гелеобразных коацерватах, образующихся в смесях ПАВ и гидрофобизированных водорастворимых полимеров, содержится большое количество воды.
Кооперативное связывание и осаждение нейтрального комплекса при малых концентрациях ПАВ можно описать в терминах произведения растворимости Ksнейтрального комплекса, образованного отрицательно заряженным ПАВ и положительно заряженным белком, согласно уравнению
Рис. 8. а — В смешанных растворах катионного белка и анионного ПАВ в широкой области составов образуется нейтральный осадок в равновесии с избытком белка в растворе, б — Количество осадка в растворах лизоцима с алкилсульфатами натрия, децилсульфатом и октилсульфатом ) линейно возрастает с увеличением стехиометрического соотношения ПАВ:белок до значения 8, равного заряду фермента. Растворение осадка происходит при более высоких концентрациях ПАВ и тем интенсивнее, чем сильнее ассоциируется ПАВ
Критическая концентрация связывания соответствует точке достижения произведения растворимости. Так как в состав комплекса входит много молекул ПАВ, критическая концентрация ПАВ слабо зависит от концентрации белка и связывание становится в значительной степени кооперативным.
Фазовое поведение растворов смесей ПАВ с белками достаточно сложное; кроме твердой фазы и фазы раствора, в очень узком интервале соотношения: возникает голубая фаза изотропного геля. Влияние возрастающих добавок ПАВ к раствору белка и схематическая фазовая диаграмма представлены на рис. 9, а и б соответственно. Разделение растворов смесей компонентов на фазы, происходящее вследствие ассоциации белка с ПАВ, аналогично свойствам растворов смесей других полиэлектролитов с ионными ПАВ; вместе с тем следует отметить и некоторые важные отличия. Во-первых, для инициирования фазового разделения раствора смеси белка и ПАВ требуется очень небольшое количество ПАВ; во-вторых, появление в ряде случаев дополнительной новой фазы, пространственная сетка которой возникает за счет частично денатурированных молекул белка.
Рис. 9. а — Последовательность изменений свойств образцов при добавлении додецилсульфата натрия в раствор лизоцима.. б — Фазовая диаграмма, схематически показаны области существования раствора, геля и осадка, а также двух- и трехфазные области
Денатурация белка при связывании ПАВ
Связывание белком ионных ПАВ, как правило, приводит к нарушению третичной структуры молекул белка. Анионные ПАВ, такие как ДСН, оказывают на белки более сильное денатурирующее воздействие, чем катионные ПАВ. Напротив, неионные ПАВ не влияют на третичную структуру белка. Денатурация белка обычно наблюдается на том участке изотерм связывания, где происходит значительное усиление неспецифических кооперативных взаимодействий. ДСН является сильным денатурирующим агентом по отношению к белкам, однако введение оксиэтиленовых групп в молекулу ПАВ приводит к резкому снижению воздействия на белок. Денатурирующее действие ДСН также снижается в присутствии неионных или цвиттерионных ПАВ. Интересно отметить, что некоторые ПАВ оказывают на белки стабилизирующее действие, повышая их устойчивость к тепловой денатурации.