Синтез, перетворення та біологічна активність поліциклічних конденсованих систем на основі 4-тіазолідонів (стр. 3 из 5)

З метою вивчення можливих шляхів хімічної модифікації похідних 9,9-R¹,R²-3,7-дитіа-5-азатетрацикло[9.2.1.0^2,10.0^4,8]тетрадецен-4(8)-онів-6, які проявили суттєву протиракову та антиоксидантну активності, опрацьовано реакції їх N-алкілювання через відповідні калійні солі.Як алкілюючі агенти для синтезу 4.1-4.7 використано етилхлорацетат та ряд N-арилхлорацетамідів. Гідразинолізом 4.7 одержано гідразид 4.8. З метою синтезу «біфармакофорних» молекул з фрагментом-носієм протипухлинної активності та тіазолідиндіоновим залишком, який повинен забезпечити афінітет до PPAR-г рецепторів, гідразид 4.8 проацильовано хлорангідридом 2,4-тіазолідиндіон-5-оцтової кислоти (4.9). Шляхом нуклеофільного приєднання фенілізотіоціанату (4.10) з наступною циклізацією у лужному середовищі фенілтіосемікарбазидного фрагменту одержано похідне 4.11 з 1-феніл-2-меркапто-1,3,4-тріазолільним фрагментом у молекулі (схема 11).

Схема 11

Відомо, що 5-(2-оксифенілметиліден)ізороданіни при взаємодії з похідними акрилової кислоти (Й.Д. Комариця, 1989; Kassab, 1976) та ангідридами дикарбонових кислот (Р.Б. Лесик, 2004) зазнають каскадної двоетапної реакції, яка проходить за «доміно»-механізмом, з утворенням оригінальних поліциклічних систем. Ми вперше встановили, що взаємодія акролеїну з 5-(2-оксифенілметиліден)ізороданінами проходить в аналогічній манері як тандемні реакції гетеро-Дільса-Альдера та утворення циклічних напівацеталів (4.14, 4.15), що інтерпретовано на основі мас- та ¹Н-ЯМР-спектрів (схема 12). Для хімічних перетворень в умовах «доміно»-реакцій ресинтезовано кислоти 4.12 та 4.13. Встановлено, що довготривале нагрівання сполуки 4.13 з ароматичними амінами та гліцином в середовищі оцтової кислоти призводить до неочікуваної рециклізації з розривом ендоциклічного естерного угрупування та утворенням спіро-заміщених сукцинімідів з тіопірано[2,3-d]тіазол-2-оновим фрагментом - 7'-(2-гідроксифеніл)-3',7'-дигідро-2H,2'H,5H-спіро[піролідин-3,6'-тіопірано[2,3-d]тіазол]-2,2',5-тріонів4.16-4.20. Використання традиційного методу одержання амідів 4.12, 4.13 через відповідні хлорангідриди не мало успіху, тому адаптовано альтернативний підхід ацилювання ароматичних амінів за допомогою N,N-дициклогексилкарбодііміду (DCC).

4. Біологічна активність нових поліциклічних конденсованих систем на основі 4-тіазолідонів

Реалізовані у роботі напрями фармакологічного скринінгу є фрагментами проекту, який базується на багаторічному досвіді наукової школи проф. М. Туркевича з корекцією на сучасні тенденції у світовій науці. Сумарні результати дослідження наведені у таблиці.

Таблиця

Загальні результати фармакологічного скринінгу

Вид активності	Сполуки-кандидати	Сполуки з достатнім рівнем активності (%)
Протипухлинна активність	59	11 (18,6%)
Антиоксидантна активність	21	8 (38,0%)
Протигіпоксична активність	15	2 (13,3%)
Протитуберкульозна активність	62	6 (9,7%)
Протисудомна активність	28	4 (14,3%)
Противірусна активність	16	1 (6,3%)

Прескринінг протиракової активності сполук (програма DTP, Національний Інститут Раку США (NCI), dr. V.L. Narayanan) проводився на 3 лініях ракових клітин: MCF7 (рак молочної залози), NCI-H460 (рак легень), SF-268 (рак ЦНС) у концентрації 10^-4 М. Згідно з критеріями NCI до другого етапу досліджень відібрані сполуки 2.2, 2.7, 2.21-2.23, 2.136, 3.23, на фоні яких мітотична активність хоча б для однієї лінії ракових клітин не перевищує 33%. З 2006 року змінилась методологія прескринінгу, тому ряд сполук тестувались у концентрації 10^-5 М на 60 лініях різних видів раку, причому для поглибленого in vitro скринінгу відібрано сполуки 2.150, 2.153 та 4.11. Для деяких сполук поглиблене дослідження протипухлинної активності проводилося без попереднього відбору.

Поглиблене дослідження in vitro полягало у тестуванні сполук у п’яти концентраціях при 10-кратному розведенні на 60 лініях людських ракових клітин, в тому числі лейкемії (6 ліній), недрібноклітинного раку легень (9 ліній), епітеліального раку (7 ліній), раку ЦНС (6 ліній), меланоми (7 ліній), раку яйників (6 ліній), нирок (8 ліній), простати (2 лінії) та молочної залози (7 ліній). Аналіз результатів протипухлинної активності дозволив виділити «сполуки-лідери» 2.22, 2.149, 2.150, 2.153, 4.3 та 4.11, для яких середнє значення lgGI₅₀<-4,80 (рис. 3), та встановити виразну селективність дії деяких речовин. Так, похідні 2.2, 2.10, 2.12, 2.21, 2.24, 2.32, 2.110, 4.3, 4.11 проявляють високу активність до клітинних ліній лейкемії, сполуки 2.150, 2.153, 3.23 – до меланоми, а 2.22 – раку молочної залози. Аналіз селективності дії до індивідуальних ліній пухлинних клітин дозволив відзначити високу чутливість клітинних ліній CCRF-CEM (лейкемія) до сполук 2.10 (lgGI₅₀=-6,11) та 2.110 (lgGI₅₀=-6,40), SR (лейкемія) - 2.32 (lgGI₅₀=-7,37), NCI/ADR-RES (рак молочної залози) - 2.22 (lgGI₅₀<-8,00), UACC-257 (меланома) - 2.153 (lgGI₅₀=-6,65).

Проведено COMPARE аналіз на рівні GI₅₀ для активних сполук 2.21-2.42 з метою вивчення аналогії селективності дії до відомих протиракових агентів, які досліджувались у NCI. Встановлено кореляцію сполук 2.22 та 2.41 (PCC = 0,705ч0,838) зі стильбеновими аналогами NSC 645646, 638485 та 603443, які є інгібіторами полімеризації тубуліну, що дозволяє передбачити зазначений механізм протиракової дії для похідних з групи 2.21-2.42.

Докінгові дослідження (програмні пакети Glide та Fred) проведені до PPARг-рецептора (коди 1FM6 та 1NYX), білкового комплексу Bcl-X_L-BH3 (1BXL) та тубуліну (1SA1), дозволили одержати ряд значень скорингових функцій, які оцінюють якість та енергію зв’язування лігандів з молекулою біомішені. QSAR-аналіз параметру протипухлинної активності lgGI₅₀ (мультиваріативний регресійний аналіз методом часткових найменших квадратів, алгоритм «simulated annealing» для відбору змінних) з використанням значень скорингових функцій та 8 молекулярних дескрипторів (Mr, LogP, TPSA, HOMO та LUMO, m, q_min, та q_max) для навчальної вибірки з сполук 2.21-2.23, 2.35-2.42 дозволив одержати достовірні QSAR моделі 1-4.

lgGI₅₀ (Breast Cancer / T-47D) = 34,787*LUMO + 0,002*ZB(tubuline) (1)

(N=11, r²=0,91, S=0,13, F=43, q²=0,82)

lgGI₅₀ (Breast Cancer / T-47D) = 35,259*LUMO – 0,015*PLP(1BLX) – 0,029*CS(1BLX) (2)

(N=11, r²=0,93, S=0,11, F=33, q²=0,88)

lgGI₅₀ (Colon Cancer / HCT-116) = 0,611*m -2,294*q_min + 0,046*CS(1FM6) (3)

(N=10, r²=0,93, S=0,07, F=32, q²=0,81)

lgGI₅₀ (CNS Cancer / SNB-19) = -0,388*LogP – 5,008*q_min – 0,035*PLP(1BLX) (4)

(N=11, r²=0,91, S=0,09, F=24, q²=0,81)

Одержані моделі вказують на найвищу кореляцію lgGI₅₀ ліній раку молочної залози, простати та ЦНС з енергією найнижчої незайнятої молекулярної орбіталі (LUMO) та значеннями скорингових функцій докінгу до молекул тубуліну та білкового комплексу Bcl-X_L-ВН3, які можна використовувати як основні потенційні мішені для дизайну сполук з протипухлинною активністю та віртуального скринінгу похідних тіопірано[2,3-d]тіазол-2-онів.

Експериментальне дослідження ліпофільності 3,7-дитіа-5-азатетрацикло-[9.2.1.0^2,10.0^4,8]тетрадецен-4(8)-онів-6 2.21-2.23, 2.35-2.42 методом зворотньофазової тонкошарової хроматографії (пластини Merck RP–18F_254S, рухома фаза - водно-ацетонові суміші) дозволило встановити ряд експериментальних показників ліпофільності R_m0 та показати, що найдостовірніше ліпофільність прогнозують програми ACD Labs та ChemOffice, про що свідчать моделі залежностей між експериментальною ліпофільністю R_m0 та розрахованими значеннями LogP цими програмами (r=0,901-0.934; q²= 0,691-0,721).

Вивчення антиоксидантної активності (АОА) проводили в модельній системі in vitro при неферментативному Fe²⁺-індукованому перекисному окисленні ліпідів (ПОЛ) на субстраті яєчних ліпопротеїдів у порівнянні з б-токоферолу ацетатом за стандартною методикою (проф. В.Д. Лук’янчук, ЛугДМУ). У результаті експерименту встановлено, що найбільш виразну АОА реалізують сполуки 2.98, 2.122, 2.102 і 2.111, які вже до 15-ої хвилини досліду зменшують рівень ТБК-реактантів на 81,58%, 48,79%, 39,83% та 26,29% відповідно, у порівнянні з контролем, причому 9-(3-етокси-4-оксифеніл)-14-(4-фторфеніл)-3,7-дитіа-5,14-діазапентацикло[9.5.1.0^2,10.0^4,8.0^12,16]гептадецен-4(8)-тріон2.98 протягом усього періоду дослідження має найвищу здатність протидіяти розвитку ПОЛ.

Дослідження протигіпоксичної активності поліциклічних тіопіранотіазолів in vivo проведено на 104 білих безпородних щурах обох статей з використанням моделі гострої гіпоксичної гіпоксії на фоні гіпертермії (проф. В.Д. Лук’янчук, ЛугДМУ). У результаті експерименту встановлено, що 10 сполук з 15 проявляють протигіпоксичну активність з термопротекторними властивостями, а максимальний протекторний ефект характерний для сполуки 2.98, про виразну протигіпоксичну активність якої свідчить здатність збільшувати виживання тварин в умовах досліджуваного патологічного стану на 83,3% в порівнянні з контролем (пентоксифілін).

Враховуючи перспективні фармакологічні характеристики потенційного антиоксидантна та антигіпоксанта 2.98, опрацьовано режим його дозування методом двофакторного експерименту на моделі гіпоксії in vivo. Методом математичного моделювання з наступним аналізом одержаних систем залежностей виживання тварин від дози встановлено, що оптимальна доза 2.98 становить 166,42 мг/кг, при часі введення 49,93 хв до початку дії подразнюючих факторів.

На основі встановленого високого антиоксидантного потенціалу 9-(4'-флуорофеніл)-3,7-дитіа-5-азатетрацикло[9.2.1.0^2,10.0^4,8]тетрадецен-4(8)-ону-6 2.23 проведено вивчення гастропротекторного ефекту сполуки на моделі імобілізаційного стресу. На основі аналізу стану системи ПОЛ-АОЗ та морфологічних змін слизової оболонки шлунка дослідних тварин встановлено здатність сполуки 2.23 запобігати розвитку оксидаційного стресу та забезпечувати гастропротекторну дію.

У результаті дослідження протитуберкульозної активності, проведеної на штамі Mycobacterium tuberculosis H₃₇R_v (АТСС 27294) в Національному інституті алергійних та інфекційних хворіб (Бетезда, США) за програмою TAACF, виділено 6 сполук-лідерів (2.27, 2.118, 2.145, 2.147, 2.151, 2.152) з виразною протитуберкульозною активністю (MIC₉₀<6,25 мкг/мл). Слід відзначити високу групову активність 3,5,10,11-тетрагідро-2H-бензо[6,7]тіохромено[2,3-d]тіазол-2,5,10-тріонів 2.145, 2.147, 2.151, 2.152 (MIC₉₀=0,677ч2,654 мкг/мл), проте певним обмеженням для їх поглибленого вивчення може стати висока цитотоксичність на VERO клітинах ссавців (IC₅₀=0,440ч1,575 мкг/мл).