Методы исследования биологически активных соединений (стр. 1 из 3)

методы исследования, применяемые для анализа, установления структуры и количественного определения биологически активных соединений являются обычными химическими, физическими или физико-химическими методами. Специфика состоит только в том, что эти обычные методы применяются для анализа определенных объектов, таких, что требования к результатам анализа могут отличаться (и часто действительно отличаются) от методов, применяемых в других случаях. В частности, это относится к исследованию и анализу соединений, являющихся лекарственными средствами – как субстанций, так и входящих в лекарственную форму.

Методы исследования биологически активных соединений можно условно разделить на три группы: химические методы, физические методы и физико-химические методы. Это деление во многих случаях является условным, потому что очень часто использование одного метода приводит к изменениям характеристик, определяемых другим методом. Например, проведение химических реакций часто сопровождается изменением окраски или выпадением осадка, что является изменением характеристик физического состояния анализируемой системы.

Для установления структуры и анализа биологически активных соединений, в основном, используются физико-химические методы, рассмотрением которых мы и займемся.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

К физико-химическим методам можно отнести следующие методы:

1. Оптические методы:

Электронная спектроскопия (спектроскопия в УФ и видимой областях спектра).

Спектрофлуориметрия.

Колебательная спектроскопия: ИК-спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния.

поляриметрия, в том числе оптический круговой дихроизм и дисперсия оптического вращения.

рефрактометрия.

2. Масс-спектрометрия.

3. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса.

4. Хроматография :

планарная – хроматография на бумаге, тонкослойная (ТСХ).

газовая (ГХ) и газо-жидкостная (ГЖХ) .

высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Применение физико-химических методов основано на использования соответствующего оборудования, с помощью которого исследователь получает искомую информацию. Эта информация всегда получается в результате обработки сигналов.

ОБРАБОТКА СИГНАЛОВ

Сигналом называются первичные данные, получаемые в ходе анализа. Это могут быть спектры, хроматограммы, какие-либо временные зависимости, например, зависимости от времени рН или оптической плотности и многое другое. Подобные данные представляют собой зависимости некоторой величины от времени, длины волны, расстояния (для данных по пространственному распределению) или иного параметра. Они включают в себя не только полезную, но и ненужную, мешающую информацию.

Аналитический сигнал, получаемый от любого прибора, всегда включает в себя полезную информацию, шум и сигнал фона. Составляющая, несущая полезную информацию, часто может быть представлена графически в форме пика. при этом, в зависимости от частоты составляющие суммарного сигнала могут быть разделены следующим образом (F 1).

Таблица 1.

ЧАСТОТА	КОМПОНЕНТА СИГНАЛА
Промежуточная	Полезная информация (пик)
Низкая	Фон, дрейф базовой линии
Высокая	ШУМ

Это легко видеть, например, на хроматограмме (F 2), где имеются как пики отдельных веществ (их площади связаны с содержаниями), так и участки базовой линии (прямой или искривленной) между ними. В общем случае при регистрации сигнала как на пики, так и на базовую линию накладывается шум (F 3). Шум может настолько перекрывать полезный сигнал, что последний становится трудно различим. Качество такого рода данных обычно характеризуют отношением (полезный сигнал/шум).

Одна из важнейших задач обработки сигналов состоит в том, чтобы отличить полезный сигнал от шума, подавить шум и таким образом извлечь из исходных данных «чистый> сигнал, увеличив количество полезной информации. При графическом представлении полезный сигнал, соответствующий индивидуальному веществу, обычно имеет форму пика, реже ступени.

Для усиления полезного сигнала используют те или иные различия между ним и шумом, в первую очередь различия в их частотах. Частота электронного шума прибора обычно гораздо выше частоты полезного сигнала. В то же время, компонента, имеющая частоту значительно более низкую, чем сигнал, также является помехой и соответствует сдвигу или дрейфу базовой линии (F 3).

Наиболее эффективные методы усиления сигнала основаны на различиях в частотах или фазах между полезным сигналом и помехами. Желательно, чтобы используемый для получения информации прибор обладал как можно меньшим уровнем шумов, поскольку в этом случае задача выделения полезного сигнала облегчается.

Наиболее распространенными методами извлечения полезной информации являются различные алгебраические преобразования, сглаживание, корреляционный анализ, свертка, дифференцирование и интегрирование. Предварительно информацию, поступающую с прибора в непрерывном аналоговом виде (например, на самописец), подвергают оцифровке для обработки и хранения ее в памяти компьютера. Устройства, применяемые для оцифровки аналоговых сигналов, называются аналого-цифровыми преобразователями (АЦП). В этом случае выделение полезного сигнала осуществляют численными методами.

Для экспериментатора, анализирующего данные, полученные на каком-либо приборе, наиболее важным является решение следующих задач:

1. Увеличение отношения сигнал/шум, сглаживание данных.

2. Улучшение разрешения перекрывающихся пиков и устранение сигнала фона.

3. Интегрирование сигналов для получения количественных данных.

Одним из наиболее распространенных методов обработки сигналов является цифровая фильтрация данных. Эту операцию сейчас осуществляют большинство современных приборов. Для такой популярности метода цифровой фильтрации есть много причин:

- соответствующее программное обеспечение можно реализовать практически на любом компьютере;

- в методе используются только простейшие арифметические операции (сложение и умножение);

- цифровые фильтры легко адаптировать к любой конкретной ситуации;

- действия, выполняемые цифровыми фильтрами, легко поддаются интерпретации.

Конечно, никакая фильтрация не может увеличить количество информации, содержащееся в данных, но она позволяет извлечь имеющуюся информацию, сделать ее более наглядной.

В основе простейшего цифрового фильтра лежит операция усреднения: серия последовательных значений заменяется их средним арифметическим. Как известно из математической статистики, среднее характеризуется меньшим уровнем шумов (стандартным отклонением), чем исходные данные.

общая для всех методов фильтрации проблема заключается в следующем. Нестационарные (т. е. изменяющиеся в пространстве и времени) данные не могут быть адекватно описаны средним. Структура данных, имеющих форму пика, при усреднении искажается.

Возможное решение проблемы состоит в таком выборе ширины диапазона (числа точек) для усреднения, чтобы сигнал усиливался, а шум подавлялся. Эта величина, называемая шириной фильтра, является одной из самых важных его характеристик. Слишком широкий фильтр подавляет структуру данных, слишком узкий — недостаточно эффективно устраняет шумы. Простейший тип цифрового фильтра называется оконным фильтром (или движущимся средним). Пример его использования приведен на рисунке (F 4). После фильтрации (F 4) структура данных выражена четче, а уровень шума ниже по сравнению с исходным спектром.

На врезке (F 4) показана конкретная форма цифрового фильтра, использованного в этом примере. В простейшем случае, когда усреднение проводится по п соседним точкам, каждая точка входит в общую сумму с коэффициентом 1/n. Например, при усреднении по 8 точкам каждая точка входит с коэффициентом 1/8.

Более сложным и более эффективным является способ фильтрации, основанный на методе наименьших квадратов. В пределах окна экспериментальные данные аппроксимируют каким-либо полиномом (например, квадратичной или кубической функцией). Широко распространен метод, который предложили Савицки и Голэй. Метод так и называется «Savizky-Golaysmoothing» - сглаживание методом Савицки-Голэя.. В этом методе задается определенное число экспериментальных точек n (ширина окна), методом полиномиальной регрессии определяется сглаженное значение для каждой точки и окно передвигается дальше, проходя таким образом всю кривую. Эффективность фильтрации этим методом иллюстрирует рис. 4.

Мы начнем с изучения оптических методов. Это связано как с универсальностью этих методов, так и с тем, что оптические методы используются для детектирования в ряде других физико-химических методов, например, хроматографии.

Несомненно, наиболее простым и наиболее распространенным из оптических методов (в смысле его применения на практике) можно считать метод электронной спектроскопии. Этот метод часто называют либо УФ-спектроскопией, либо просто спектроскопией. Если химик говорит, что нужно снять спектр, определенно имеется в виду спектр в видимой или ультрафиолетовой (или в обеих) областях спектра, т.е. электронный спектр.

Видимый спектр. Спектроскопия как наука возникла после открытия Ньютона (около 1672 г.), показавшего, что величина преломления света при прохождении его через призму меняется в зависимости от цвета. Этот вывод был сделан после того, как было обнаружено, что изображения окрашенных тел при наблюдении их через призму в большей или меньшей мере смещаются в соответствии с различиями в окраске. Было установлено также, что изображение синего тела смещается больше, чем изображение красного.