R-+H+ ↔ R-H+,
а при высоких рН подобным образом при действии щелочи нейтрализуются аниониты:
R++OH- ↔ R+OH-.
Поскольку ионообменная емкость сильных катионитов падает до нуля при низких рН, они не могут быть использованы при рН<1. Сильные аниониты должны применяться при рН<11, слабые катиониты при рН>6, а слабые аниониты при рН<8. Из рисунка видно, что сильные ионообменники могут быть использованы в более широком диапазоне рН, чем слабые. Этим объясняется широкое применение сильных ионитов, на которых может быть разделено большее количество веществ разных классов одновременно, особенно если используется градиентное изменение рН. Сильно удерживаемые вещества, нестойкие при крайних зна чениях рН, могут разделяться на слабых ионитах. Еще раз подчеркнем, что сильные иониты полностью ионизированы в диапазоне рН=2–11. Слабые иониты полностью ионизированы в ограниченной области рН, и их ионизацией можно управлять, меняя рН элюента в пределах диапазона рабочих значений рН.
Таким образом, к категории слабых могут быть отнесены ионообменники, значительно отличающиеся друг от друга. Для них характерно не толыко сужение рабочего диапазона рН, но и уменьшение прочности сорбции вещества внутри этого диапазона. Слабым ионообменникам, в частности анионитам с замещающими группами диэтиламиноэтила (ДЕАЕ), отдают предпочтение в тех случаях, когда необходимо элюирование в мягких условиях, например, при разделении белков и пептидов.
Наибольший интерес в качестве сорбентов для ионообменной хроматографии представляет химически модифицированный силикагель, получаемый прививкой к силикагелю ионогенных групп.
Таблица 1. Характеристика модифицированных силикагелей и ионообменных смол
| Характеристика | Силикагель | Смола (сополимеры полистирола с дивинилбензолом) |
| Типичный диаметр частицы в мкм | 5–10 | 7–10 |
| Типичная ионообменная емкость, в мэкв/г | 0,5–2 | 3–5 |
| Стойкость к деформации давлением | Очень хорошая | От удовлетворительной до плохой (в зависимости от степени сшивки) |
| Форма | Сферическая или неправильная | Сферическая |
| Перепад давления на колонке | Высокий | Очень высокий |
| Эффективность | Высокая | Низкая |
| Метод набивки | Суспензионный | Суспензионный |
| Диапозон рН | 2–7,5 | 0–12 (анионообменные) 0–14 (катионообменные) |
| Скорость регенерирования | Умеренная | Медленная |
Применение этих материалов значительно увеличивает стабильность работы колонок, в которых не происходит изменения эффективности. Однако сильнокислые или сильноосновные среды (2>рН>7,5) могут воздействовать на силикагель, выводя из строя колонку. Привитые к силикагелю ионообменники могут быть нестабильны при действии органических растворителей, концентрированных буферных растворов, высоких температур. Ионообменные силикагели зернением 10 или 5 мм не набухают, не сжимаются, как смолы, и отличаются от них большИМ размером и доступностью внутренних пор как для ионов образца, так и для противоионов. Благодаря этому быстрее устанавливается массоперенос даже без повышения температуры и значительно возрастает эффективность сорбента.
Не существует слабых катионитов на основе силикагеля, так как при рН<8 материал не ионизирован, а при рН>8 разрушается подложка наполнительного материала. Сравнительные характеристики модифицированных силикагелей и ионообменных смол, применяемых в ионообменной хроматографии, даны в табл. 1.
Выбор подвижной фазы и условий разделения
Подвижная фаза в ионообменной хроматографии должна обеспечивать растворимость различных солей и создание буферного раствора, необходимых для ионного обмена, контроль степени удерживания образца за счет использования растворителя нужной силы, получения необходимой селективности разделения.
Ионообменное, разделение обычно выполняют при применении водных растворов солей, которым придаются буферные свойства. Иногда добавляют в подвижную фазу небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей – метанола, этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от значения рН и от вида и концентрации добавленных органических растворителей.
Удерживание в ионообменной хроматографии зависит от двух процессов: распределения образца между водной подвижной фазой и органической неподвижной и образования ионных пар (т.е. анионного или катионного обмена), причем последний процесс доминирует.
Распределение вещества между фазами зависит от силы электростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника. Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные связи, могут взаимодействовать с материалом матрицы неспецифически.
Степень удерживания образца снижается с увеличением ионной силы подвижной фазы и увеличивается с увеличением ионообменной емкости сорбента. Ионная сила подвижной фазы возрастает при возрастании концентрации буфера и сохранении неизменным рН или при добавлении соли. Важна также концентрация буферных растворов, так как в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера. Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к образцу, что приводит к увеличению времени удерживания. Концентрация буферного раствора колеблется от 0,001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя – самой буферной силой, так как в слабом буферном растворе нельзя контролировать уровень рН. Сильных буферных растворов также следует избегать, так как возможно выпадение осадка и забивание колонок. Сила растворителя зависит от типа противоиона, причем степень удерживания образца увеличивается в ряду, обратном ряду активности ионов, приведенному выше.
При анализе рН раствора выбирают таким образом, чтобы молекула образца была полностью ионизирована, обычно для кислот рН≅рКα+1,5, а для оснований рН≅рКα+1,5. Изменение рН подвижной фазы влияет на удерживание образца. Оно с повышением рН увеличивается при анионообменном разделении и уменьшается при катионообменном, т.е. происходит уменьшение силы растворителя при анионном и увеличение при катион-ном обмене. Особенно сильно влияет изменение рН раствора, происходящее вблизи значений рКα образца.
В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды. Ионообменное разделение проходит в пределах температур от комнатной до 60 °С. Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы и тем эффективнее разделение. Однако при высокой температуре стабильность колонки или образца может быть нарушена. Многие ионо-обменники выдерживают температуру до 60 °С, а некоторые полимерные катионообмен-ники – даже до 80 °С. Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4 °С, хотя в современной ВЭЖХ при быстрых разделениях вероятность разрушения образца при 20–30 °С резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению k' для всех компонентов образца, а снижение ионной силы подвижной фазы может привести к обратному явлению.
Вводимые количества образца не должны превышать 5% суммарной ионообменной емкости. Так, для соединений с молекулярной массой 200–500 предполагается введение около 50 мг пробы на 1 г полимерного сорбента. Желательно, чтобы вводимый объем образца не превышал 1/3 объема первого интересующего пика.
В подвижную фазу добавляют иногда органические растворители (метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан), действие которых аналогично добавлению растворителей в обращенно-фазной хроматографии: при увеличении их количества степень удерживания образца снижается, и этот эффект более силен для менее полярных растворителей. Добавлением органических растворителей можно добиться также изменения селективности системы. Таким образом, снижают время удерживания в ионообменной хроматографии следующие факторы: 1) повышение температуры; 2) повышение концентрации буферного раствора; 3) снижение степени ионизации вещества за счет изменения рН.
Ионная хроматография
Особым видом ионообменной хроматографии, применяемым для анализа органических и неорганических ионов, не поглощающих в УФ-области, является ионная хроматография. В этом методе ионообменное разделение ионов сочетают с кондукто-метрическим определением их. Поскольку высокочувствительное кондуктометрическое определение возможно только при невысокой фоновой электропроводности потока жидкости, поступающей в детектор, фоновый электролит подвижной фазы предварительно удаляют пропусканием его через ионообменные смолы.
Предложены два основных метода ионной хроматографии.
1. Двухколоночная ионная хроматография, основанная на компенсации (подавлении) электролита, содержащегося в элюенте для разделения смеси ионов на колонке с помощью второй ионообменной колонки, расположенной между детектором и раздели тельной колонкой. Этот метод и был ранее назван ионной хроматографией.
Вещества разделяются на катионообменной колонке 4 по ионообменному механизму, попадают в десорбционную колонку 5 со смолой в ОН-форме, где происходит нейтрализация подвижной фазы и удаление электролита из элюента. Анализируемые вещества выходят из колонки 5 в деионизиванной воде и попадают в кондуктометрическую кювету 6. Сигнал с кондуктометра 7 поступает на самописец 8 или интегратор. На аналогичной установке анализируют анионы. Так как десорбционную колонку приходится часто регенерировать, отношение объемов, пропущенных через колонку 5, к объемам, допущенным через колонку 4, должно быть меньше или равно 1O. Предложений схемы разделения для ионной хроматографии и варианты заполнения разделительной и десорбирующей колонок.