Ингибирование ферментативной активности (стр. 2 из 3)

Некоторые аналоги витамина В₆ и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин, действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологические процессы в организме. Применение подобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстратсвязывающих центров ключевых ферментов обмена (Т.Т Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

Таким образом, можно конструировать лекарственные вещества, ингибирующие ферменты по конкурентному типу. Чтобы быть эффективным, ингибитор должен иметь высокое сродство к ферменту. В противном случае необходимо назначать большие дозы лекарственных препаратов, чтобы активно конкурировать с эндогенным субстратом за активный центр фермента (В.П. Комов, В.Н. Шведова, 2004).

1.1.2 Неконкурентное ингибирование

Неконкурентное ингибирование тоже обратимо, но не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата

В случае неконкурентного ингибирования ингибитор присоединяется к ферменту не в активном центре, где связывается субстрат, а совсем в другом месте. При этом конформация молекулы фермента изменяется таким образом, что происходит обратимая инактивация его каталитического центра. Неконкурентные ингибиторы связываются обратимо как со свободным ферментом, так и с комплексом ES, образуя неактивные комплексы EI и ESI.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым (Н.З. Хазипов, А.Н. Аскарова, 2001).

Использование графиков, построенных в двойных обратных координатах для анализа данных, полученных при исследовании ингибирования ферментативных реакций, позволяет легко отличать конкурентные ингибиторы от неконкурентных.

Наиболее важные неконкурентные ингибиторы представляют собой образующиеся в живых организмах промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться со специфическими участками на поверхности некоторых регуляторных ферментов и изменять при этом активность их каталитических центров. Примером может служить ингибирование L-треониндегидратазы L-изолейцином (А. Ленинджер, 1985).

Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.

Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.

Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

1.1.3 Бесконкурентное ингибирование

В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата. Для этого типа торможения был предложен термин "бесконкурентное ингибирование".

Бесконкурентное ингибирование имеет место, когда ингибитор взаимодействует с ферментом только в составе фермент-субстратного комплекса, препятствуя его распаду (Уэбб Л., 1966).

Примером необратимого действия ингибиторов на ферменты могут служить фосфорорганические вещества, применяемые в качестве инсектицидов.

Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса ESI(Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом, но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор, в свою очередь, так меняет конформацию фермента, что катализ становится невозможным

Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса EIS (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

Ингибирование субстратом — частный случай бесконкурентного ингибирования, когда две молекулы субстрата связываются с ферментом, что препятствует образованию продукта

Активность многих ферментов тормозится избытком субстрата, причем имеется несколько механизмов этого процесса.

1) Если в образовании фермент-субстратного комплекса участвует несколько функциональных групп фермента, то возможно одновременное присоединение к активному центру двух или более субстратов, что однозначно приведет к образованию неактивного комплекса.

2) В случае избытка субстрата возможно его присоединение не только к активному центру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным с активным центром. Такого рода взаимодействие может помешать ферментативной реакции.

3) Увеличение концентрации субстрата может повысить ионную силу реакционной среды и, как следствие, затормозить скорость ферментативной реакции.

Торможение продуктами реакции связано с тем, что они могут связываться с ферментом или с каким-либо другим компонентом системы таким образом, что скорость прямой реакции снижается.

1.2 Необратимое ингибирование

Необратимые ингибиторы связывают или разрушают функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его каталитической активности. Происходит формирование стабильного комплекса ингибитора с ферментом, ведущее к его необратимой инактивации. Случай необратимого ингибирования можно обнаружить по тому признаку, что при разбавлении раствора не происходит повышения удельной активности фермента, как в случае обратимого ингибирования.

Примером необратимого ингибитора может служить соединение диизопропилфторфосфат (ДФФ), которое ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющий важную роль в передаче нервных импульсов. Ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина, функционирующего в качестве нейромедиатора в определенных отделах нервной системы. Ацетилхолин выделяется стимулированной нервной клеткой в синапс, т.е. место соединения одного нейрона с другим. В синапсе ацетилхолин связывается с рецепторами следующего нейрона, вынуждая его проводить нервный импульс. Однако прежде чем второй импульс будет передан через синапс следующему нейрону, ацетилхолин, выделившийся после первого импульса, должен быть гидролизован ацетилхолинэстеразой в месте соединения нервных клеток. Продукты его распада - ацетат и холин - не способны действовать как нейромедиаторы. Необратимый ингибитор ДФФ, обладающий высокой реакционной способностью, присоединяется к гидроксильной группе остатка серина в активном центре ацетилхолинэстеразы, что приводит к образованию каталитически неактивного производного. В результате фермент перестает функционировать. ДФФ, одно из первых отравляющих веществ нервнопаралитического действия, в опытах на животных вызывает нарушение некоторых функций вследствие того, что пораженные нейроны утрачивают способность проводить нервные импульсы. Однако ДФФ обладает и полезными свойствами. На его основе был создан ряд относительно нетоксичных для людей и животных инсектицидов, например малатион. Сам по себе малатион неактивен и в организме высших животных разлагается на продукты, которые считаются безвредными. В организме же насекомых малатион превращается под действием ферментов в активный ингибитор их собственной ацетилхолинэстеразы.

Выяснилось, что ДФФ ингибирует целый класс ферментов, многие из которых способны катализировать гидролиз пептидов или эфирных связей. К этим ферментам относится не только ацетилхолинэстераза, но и трипсин, химотрипсин, эластаза, фосфоглюкомутаза и коконаза (фермент, выделяемый личинкой тутового шелкопряда и используемый ею для гидролиза шелковых нитей и освобождения из кокона). Характерная особенность всех ферментов, ингибируемых ДФФ, состоит в том, что они содержат в активном центре остаток серина, принимающий участие в каталитическом акте

Другой необратимый ингибитор некоторых ферментов, иодацетамид может взаимодействовать с сульфгидрильными (—SH) группами остатков цистеина или с имидазольными группами остатков гистидина, содержащихся в активных центрах этих ферментов. С помощью таких ингибиторов было установлено, что гидроксильная группа серина, тиоловая группа цистеина и имидазольная группа гистидина участвуют в каталитической активности ферментов, принадлежащих к разным классам.