Выделение белков (стр. 4 из 5)

Таким образом, присоединение лиганда к сефарозе, активированной бромцианом, одновременно создает на матрице эквивалентное содержанию лиганда число катионных групп. Следовательно, такой сорбент помимо био- специфического связывания белка лигандом может проявлять свойства анионита, что необходимо учитывать при его использовании.

Известны и другие способы присоединения лнгандов к матрице, однако в каждом случае следует учитывать изменения в характере носителя, сопровождающие реакцию с лигандом, а также большую или меньшую неустойчивость образовавшейся связи, которая иногда может вызывать постепенную "утечку" лиганда. Например, изомочевина может превращаться в производное гуанидина в присутствии значительных концентраций первичных аминов или аммиака, что влечет за собой отщепление лиганда.

Сложнее требования, предъявляемые к лиганду.Он прежде всего должен достаточно сильно взаимодействовать с белком. Так, принято считать, что для получения сорбентов, предназначенных для выделения ферментов, в качестве лигандов могут быть использованы такие ингибиторы или аналоги субстрата, которые имеют константу ингибировавия (субстратную константу), т.е. константу диссоциации фермент — лиганд, не хуже 10^-4 М. При этом учитывается, что присоединение лиганда к матрице ухудшает (т.е. повышает) константу ингибирования по крайней мере на один порядок.

При подборе лигандов для аффинной хроматографии ферментов приходится изменять структуру субстрата, чтобы предотвратить возможность его превращения ферментом в продукт, например, расщепления пептидного лиганда, если речь идет о хроматографии протеиназ. Очевидно, что сорбент, содержащий в качестве лиганда истинный субстрат, будет трансформирован при первом же контакте с ферментом и окажется непригодным.

При пропускании раствора, содержащего сложную смесь белков, других биополимеров, низкомолекулярных соединений, солей, пигментов и т.п., через биоспецифический сорбент, построенный по описанной выше схеме, лнганд образует комплекс только с тем белком, который имеет участок связывания, комплементарный структурелиганда. В результате именно этот белок удерживается аффинной колонкой, тогда как все остальные компоненты смеси проходят через нее не задерживаясь.

После промывания колонки для удаления неспецифически удерживаемых примесей белок элюируют, изменяя состав протекающего через колонку раствора так, чтобы ослабить взаимодействие белка с лигандом. Для этого прибегают к изменению рН, добавляют к элюенту неорганические соли, органические растворители. Все эти факторы, воздействуя на структуру зоны связывания лигвнда и подавляя от дельные виды белок-лиг видных взаимодействий, например ионные связи и гидрофобные контакты, обеспечивают десорбцию. В отдельных случаях прибегают к аффинной элюции раствором лиганда или его аналога. Этот прием, основанный ив конкуренции за связывание белка между присоединенным к матрице и растворенным лигандами, весьма специфичен и эффективен, но дорог.

В качестве примера рассмотрим применение циклопептидного антибиотика — грамицидина S— в качестве лиганда при аффинной хроматографии протеолитических ферментов. Он содержит ряд гидрофобных аминокислот, соответствующих специфичности многих протеиназ, и два остатка орнитина, δ-аминогруппы которых позволяют легко присоединить циклопептид к активированной бромцианом сефарозе или другим матрицам:

Остаток орнитина, аминогруппа, которого присоединена к активированной бромцианом сефарозе.

Грамицидин S связывает протеиназы различных классов, однако он устойчив к их действию и не подвергается гидролизу, по-видимому, из-за присутствия в структуре остатков D-фенилаланина, пролина, а также из-зa особенностей конформации циклопептида. Следовательно, грамицидин S является природным аналогом субстратов протеназ и хорошо подходит для роли лигаида широкой специфичности. Так, при пропускании через колонку с грамицидин-5-сефарозой сложной смеси веществ, содержащихся в культуральной жидкости одного из штаммов бактерии Bacillus subtilis,сорбент связывает только металлопротеиназу, которую удается полностью освободить от примесей и получить практически чистый белок.

Еще эффективнее сорбенты, содержащие такие лиганды, которые взаимодействуют не только с зоной связывания, но и с каталитическим центром фермента. Например, производные бензилянтариой кислотыоказались хорошими лигандами для выделения карбоксипептидаз — ферментов, отщепляющих аминокислоты от карбоксильного конца пептидной цепи. Сходство лигандов с субстратами карбоксипептидаз на первый взгляд невелико, однако оказывается, что группа

HООC^-

способна выступать в качестве своеобразного аналога пептидной связи:

В результате

-карбоксильная группа бензилянтарной кислоты взаимодействует с каталитическим центром фермента, а боковая бензильная группа и ошарбоксил — с компонентами зоны связывания субстрата. Образующийся комплекс лиганда, обычно присоединяемого к матрице через аминогруппу, введенную в паpаположение бензольного кольца, связывает фермент весьма прочно.

Широко используют своеобразный вариант аффинной хроматографии, основанный на применении в качестве лигандов синтетических красителей антрахинонового ряда, например цибакрона голубого;

Плоская структура, образованная тремя конденсированный и ароматическими кольцами замещенного антрахинона, к которому в положении 1 присоединены замещенный анилин и триазиновый цикл, способна избирательно взаимодействовать с целым рядом белков. Лиганд связывается, по-видимому, во впадинах, которые нередки на поверхности белков, в особенности в активных центрах ферментов. Высказывались предположения, что антрахиноны вместе с присоединенными ядрами анилина и триазина образуют структуру, стерически близкую природным лигандам, например таким коферментам, как NAD, и имитируют свойственный последним способ связывания с белками. Ввиду этого сорбенты, содержащие цибакрон голубой и некоторые другие антрахиноновые красители, особенно рекомендуются для аффинной хроматографии белков, содержащих NAD или иные соединения нуклеотидной природы.

Нет необходимости, чтобы нуклеотид или сходное по строению соединение было похоже на субстрат — оно может имитировать эффектор, регулирующий активность фермента. Так, например, хорошие результаты дает хроматография на антрахиноновых красителях аспартаткарбомилазы, где нуклеотиды выступают как аллостерические эффекторы.

Впрочем, круг белков, связываемых этими сорбентами, значительно шире и включает, например, сывороточный альбумин. Последний легко присоединяет различные лиганды, в том числе некоторые лекарственные препараты и триптофан, который можно (с большими оговорками) считать напоминающим конденсированные кольца антрахиноиа. Структура лиганда— замещенного антрахинона — не безразлична, поэтому, используя разные красители, удается получить серию сорбентов, не одинаково связывающих различные белки.

Иммуносорбция

К числу наиболее специфических принадлежит взаимодействие белков с антителами — иммуноглобулинами.Это свойство с успехом используют для создания биоспецифических сорбентов, в которых роль лиганда выполняют специфические в отношении выделяемого белка иммуноглобулины. Получение и применение такого рода сорбентов происходят примерно так же, как и в обычной аффинной хроматографии, отличаясь лишь немногими особенностями. Во-первых, присоединение иммуноглобулина G к матрице необходимо проводить в щадящих условиях.Установление между молекулой антитела и носителем множества ковалентных связей (которое может произойти, если добиваться повышения емкости сорбента) благоприятствует денатурации белка и может, следовательно, привести к утрате специфичности антитела.

Во-вторых, использование обычных, поликлональных, антител, которые представляют собой весьма сложную смесь молекул иммуноглобулинов различного строения, приводит к получению сорбента, в котором содержатся антитела с широким диапазоном сродства к выделяемому белку-антигену. Это затрудняет его сорбцию и в особенности десорбцию, так как диссоциация целого набора неодинаковых комплексов антиген—антитело может потребовать вариации условий алюции в весьма широком интервале, вплоть до весьма жестких. Это осложнение снимается, если доступны моноклональныеантитела, представляющие собой однородные молекулы иммуноглобулина. Десорбция и в этом случае может доставлять некоторые трудности из-за прочности комплекса, однако их удается преодолеть, подавляя нековалентные взаимодействия между выделяемым белком и иммуноглобулином при помощи изменения рН, ионной силы, добавления в элюент органических растворителей или мочевины.

Иммуносорбция особенно уместна как высокоспецифичный метод выделения небольших количеств особо ценных белков из сложных смесей, поскольку используемые сорбенты дороги и недолговечны из-за склонности иммуноглобулинов к денатурации. Очень важно, что к иммуносорбции можно прибегнуть даже в таких случаях, когда сведения о свойствах белка, в том числе и о его функции, скудны. Если известна первичная структура, определенная по нуклеотидной последовательности гена, то возможно синтезировать ряд фрагментов его пептидной цепи и, присоединив их к белку-носителю, иммунизировать таким конъюгатом животное. Это дает возможность получить антитела к исследуемому белку, несмотря на то что он не только не выделен, но и его функция пока неизвестна. Иммуносорбенты, синтезируемые присоединением таких антител к подходящему носителю, позволяют выделить белок.