Выделение белков (стр. 3 из 5)

Ионогенные группы фосфоцеллюлозыслабее, чем у сульфопропилсефадекса, но сильнее карбоксильных. Оказалось, что этот ионообменник может применяться в качестве биоспецифического сорбента при выделении некоторых ферментов фосфорного обмена.

Среди анионитов наибольшее распространение получили диэтил-амииоэтил (DEAE)-целлюлоза и ее аналоги с иными матрицами:

Диэтиламиноэтильная группа, присоединенная к целлюлозе или другой полисахаридной матрице.

Основность диэтиламиноэтильной группы в сорбентах этого типа несколько ниже обычной из-за влияния окружающих ее гидроксильных групп, так что ее р

равен 9,5. DEAE-целлюлоза эффективна как аннонообменник вплоть до рН 8,5 — 9,0. Аниониты, содержащие четвертичные аммонийные группы, — QAE-сефадекс или QAE-сефароза— сохраняют положительный заряд и при более высоких рH.

Хроматография белков иа DAEA-целлюлозе и аналогичных аниони-тах, подобно хроматографии на катионах, определяется многоточечным связыванием отрицательно заряженных групп белка (прежде всего карбоксильных) с катионными группами ионообменника. Как и при хроматографии на катионитах, десорбции белков достигают повышением ионной силы элюирующего раствора, ее можно проводить ступенчато или с применением градиента концентрации соли. И в этом случае не рекомендуют градиенты pH и использование растворов, содержащих разные анионы. Например, при десорбции белков хлористым натрием с DEAE-целлюлозы, уравновешенной ацетатным буфером, помимо экранирования разноименно заряженных групп сорбента и белка происходит замещение удерживаемых анионитом ацетат-ионов ионами хлора. Если элюция проводится в слабокислых растворах, десорбированные ацетат-ионы, связывая протоны, вызовут сдвиг рH в щелочную сторону, что приведет к локальному изменению условий элюции и сделает процесс трудно контролируемым.

В последнее время в хроматографии белков все шире применяют ионообменники на основе гидрофильных органических полимеров,получаемых в форме шариков строго одинакового диаметра (10 мкм) и обладающих большой рабочей поверхностью. Стандартность гранул таких ионитов снижает размывание хроматографических пиков за счет различий во времени диффузии белковых молекул внутри сорбента — фактор, ограничивающий эффективность обычных ионообменников с неодинаковыми гранулами. Носители этого типа жестки, что позволяет достигать весьма высоких скоростей протекания растворов через колонку при давлении порядка 20 атм. Совместное действие этих факторов резко повышает эффективность и скорость хроматографии белков на такого рода сорбентах, получившей название быстрой жидкостной хроматографии белков(английское сокращенное обозначение FPLC). В качестве сорбентов используют Moho-Q — сильный анионит с четвертичными аммонийными группами, Moho-S — сильный катионит, содержащий сульфогруппы, или Моно-P— катионит с фосфатными группами.

Очистка щелочной фосфатазы ионообменной хроматографией:

1 - оптическая плотность при 280 ни, отражающая общее содержание белка; 2 - активность щелочной фосфазы;

А - разделения неочищенного препарата на аиионите Моно-Q при рН 8 в градиенте концентрации NaCl 0-0.35 М (3):

Б - хроматофокусирование на Моно-Р щелочной фосфатазы, очищенной на предыдущей стадии в градиенте рН (4);

В - хроматография фракции, выделенной на Моно-Р, на анионите Моно-Q в градиенте концентрации NaCl (5)

К сожалению, до сих пор не удалось разработать достаточно эффективный способ препаративного электрофореза белков в гелях, хотя их аналитическое разделение электрофорезом в полиакркламидном геле дает очень хорошие результаты и является ведущим методом в исследовании белковых смесей и индивидуальных белков.

Гидрофобная хроматография белков

Как известно, поверхность белковой глобулы богата гидрофильными аминокислотами, но в то же время содержит немало (до половины от их общего содержания) гидрофобных остатков, нередко образующих скопления ("гроздья"). Такие гидрофобные зоны, развитые в большей или меньшей степени, представляют характерную особенность структуры каждого белка, на чем и основан метод гидрофобной хроматографии. Соответствующие сорбенты синтезируют, включая гидрофобные группировки в гидрофильную матрицу, например в поперечно-сшитую агарозу — сефарозу. По такому принципу построены, в частности, октил- и фенилсефароза:

При пропускании белкового раствора через фенилсефарозу гидрофобные участки поверхности белков образуют контакты с фенильными группами, вытесняя прилегающие к этим структурам молекулы воды. Число и прочность таких контактов весьма различны у разных белков. Повышению их прочности способствует сорбция белков из концентрированных растворов солей, например сульфата аммония. Плавное понижение концентрации соли в растворе, протекающем через колонку с фенилсефарозой, приводит к поочерёдной десорбции белков.

Сходным образом действуют сорбенты, полученные присоединением к макропористому кремнезему гидрофобных алкильных радикалов

различной длины. Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давлении в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC). Те из них, которые содержат длинные —

-уг леводородные цепи, малопригодны для разделения белков из-за слишком сильного, нередко необратимого связывания, ио могут применяться для хроматографии пептидов. Лучшие результаты дает хроматография белков на сорбентах, содержащих более короткие — С₄— углеводородные цепи.

Нередко гидрофобная хроматография сочетается сдругими эффектами. Например, присоединение к активированной бромцианом сефарозе диаминов различной длины дает сорбенты, в которых содержатся гидрофобные углеводородные цепочки наряду с двумя катионными группами. Объединение черт гидрофобного сорбента и анионита в одном хроматографическом материале обогащает его.

Описанный выше способ проведения хроматографии на гидрофобном сорбенте — далеко не единственно возможный. Для сорбции белков не обязательно введение в раствор повышенных концентрация соли, а для элюцни можно применять добавление органических растворителей, сдвиг рН. В некоторых случаях, когда связывание белка основано на сочетании гидрофобных и ионных взаимодействий, хорошие результаты дает элюция растворами солей. Отметим также, что признаки гидрофобной хроматографии встречаются и в других приемах разделения белков, в особенности в аффинной хроматографии.

Аффинная, или биоспецифическая. Хроматография белков

Как уже отмечалось, способы разделения белков, основанные на различиях в их физико-химических свойствах, не могут быть высокоспецифичными. С этой точки зрения гораздо перспективнее препаративные методы, которые базируются на функциональных различиях белков. Для множества белков, включая ферменты, их ингибиторы, транспортные белки, иммуноглобулины, регуляторные белки, токсины, рецепторы, — главнейшая функциональная черта состоит в способности избирательносвязывать те илииныелиганды— субстраты, коферменты, аллостерические эффекторы, антигены и т.п.

Такое связывание по существу своему весьма специфично, и это свойство резко выделяет тот или иной белок из множества других. На использовании функционально обусловленной способности белков обратимо связываться с соответствующими лигандами и основан метод аффинной, или биоспецифичгсгой. хроматографии.

Для синтеза аффинного сорбента отвечающий специфичности данного белка лиганд(субстрат или его аналог при хроматографии фермента) присоединяют кинертной матрицетак, чтобы возможно меньше затронуть те элементы его структуры, которые непосредственно участвуют во взаимодействии с белком. Иногда лиганд прямо вводят в реакцию с функциональными группами на поверхности матрицы, однако чаше их соединяют через промежуточное звено ("вставку", "ножку" и т.п.), чтобы отдалить лиганд от матрицы и уменьшить пространственные препятствия для его сближения с белком.

К каждому из элементов структуры аффинного, сорбента предъявляются определенные требования. Матрица должна быть инертной и не создавать стерических препятствия для белка. Чаще всего в качестве матрицы используют микропористые гели, образованные поперечно-сшитыми гидрофильными полимерами, например производное агарозы — сефарозу, синтетические полимеры или неорганические носители макропористые производные кремнезема — силикагель или стекло. Присоединение лигандов к сефарозе (непосредственно или через вставку) обычно проводят, активируя ее бромцианом. Бромциан (сильный яд!) в щелочкой среде реагирует с гидроксильными группами сефарозы, образуя весьма активный эфир изоциановой кислоты:

Последний взаимодействует затем с аминогруппами лиганда L или "вставки" с образованием производного изоыочевнны, которое является сильным основанием и в обычном диапазоне рН песет положительный заряд: