Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii (стр. 6 из 11)
Все опыты, описанные в работе, проводили 3 –4 раза, аналитические определения для каждой пробы проводили в двух – трёх повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из двух или трех определений. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕИНАЗЫ
PENICILLIUM WORTMANNII 2091 И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.
Известно, что микроорганизмы синтезируют богатые набором ферментов комплексы. Поэтому важным этапом в получении препаратов направленного действия является изучение условий их выделения, очистки от сопутствующих биологически активных и баластных веществ. В связи с малой изученностью представителей грибов Penicillium этот этап представляет особую важность.
3.1 Разработка условий выделения препарата
Penicillium wortmannii BKMF 2091.
Для выделения ферментов из различных сред в лабораторных условиях и в промышленности чаще всего применяют органические растворители и нейтральные соли.
Эффект осаждения белков органическими растворителями, как известно [7], основан на явлении уменьшения сольватации полярных групп фермента. Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение белковых молекул.
В качестве осадителей использовали 96,5% этанол, 98,0% изопропанол, химически чистый ацетон и сульфат аммония. Органические растворители и сульфат аммония добавляли к охлажденной до 0 – 4oС культуральной жидкости Pen. Wortmannii 2091 при различных значениях рН и постоянном перемешивании. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, растворяли в небольшом объёме дистиллированной воды и определяли протеолитическую активность.
Результаты исследования влияния рН на полноту осаждения протеолитического комплекса при концентрации растворителей 60% представлены на рис. 1, из которого видно, что оптимальным является значение рН 7,5 при использовании всех видов органических растворителей. Вероятно, изоэлектрическая точка для данного фермента лежит в этой области рН.
В дальнейшем нами проводились исследования по влиянию концентрации органических растворителей на выход фермента при оптимальном значении рН. Наблюдалось монотонное осаждение фермента при последовательном увеличении концентраций осадителей, выход фермента возрастал до определённого предела (табл. 1).
Как видно из табл. 1, концентрация органических растворителей значительно влияет как на выход протеолитического комплекса, так и на степень его очистки. При использовании этанола наиболее эффективной для выхода ПА была концентрация 72,0%. Степень очистки 1,27. Максимальный выход 98,5% по активности.
Оптимальная концентрация ацетона 66,6% (в объёмных соотношениях 1: 2). Степень очистки была более высокой, чем для этанола (1,5 раза) – однако выход по активности всего 62%. Лучшим органическим осадителем для протеиназы Pen. Wortmannii 2091 явился изопропанол. При концентрации его в смеси 50% выход протеиназы составил 90, 5%, степень очистки 2,78 и удельная активность 3,06.
Таким образом, изопропанол избирательно осаждает протеолитические ферменты, что повышает степень их очистки и снижает содержание баластных примесей. Однако на практике вполне можно использовать и этанол.
В дальнейшем проведены исследования по осаждению протеиназы сульфатом аммония. Было установлено, что при оптимальных условиях (степень насыщения 0,8 рН 7,5) выход фермента составил всего 23%. Низкий вы-
 | ||
| Содержание осадителя | Общая активность, ед | Белок, мг/см3 | Общий белок, мг | Вес препаратов, мг | Удельная активность, ед/мг белка | Выход по активности, % | Очистка | |
| В объёмных отношениях | В % | |||||||
| Ацетон | ||||||||
| Культуральная жидкость рН 7,5 | ||||||||
| - | - | 2,5 | 2,250 | 62,5 | - | 1,10 | 100,0 | 1,00 |
| 1:1 | 50 | 179,0 | 0,180 | 21,6 | 120 | 0,99 | 17,4 | 0,90 |
| 1:2 | 66,6 | 222,0 | 0,133 | 46,4 | 349 | 1,67 | 62,0 | 1,50 |
| 1:3 | 75,0 | 213,0 | 0,233 | 51,9 | 223 | 0,91 | 38,0 | 0,82 |
| 1:4 | 80,0 | 203,0 | 0,216 | 64,6 | 299 | 0,94 | 49,0 | 0,85 |
| Изопропанол | ||||||||
| Культуральная жидкость рН 7,5 | ||||||||
| - | - | 2,5 | 2,250 | 62,5 | - | 1,10 | 100,0 | 1,00 |
| 1:1 | 50,0 | 392,0 | 0,128 | 36,9 | 288 | 3,06 | 90,5 | 2,78 |
| 1:2 | 66,6 | 385,4 | 0,232 | 67,4 | 290 | 1,65 | 92,0 | 1,50 |
| 1:3 | 75,0 | 215,0 | 0,282 | 211,5 | 350 | 0,76 | 60,0 | 0,69 |
| 1:4 | 80,0 | 183,0 | 0,132 | 42,2 | 320 | 1,39 | 46,0 | 1,26 |
| Этанол | ||||||||
| Культуральная жидкость рН 7,5 | ||||||||
| - | - | 2,5 | 2,250 | 62,5 | - | 1,10 | 100,0 | 1,00 |
| 1:1 | 48,0 | 320,3 | 0,396 | 85,1 | 215 | 0,80 | 55,0 | 0,73 |
| 1:2 | 64,0 | 366,7 | 0,340 | 90,1 | 265 | 1,08 | 77,6 | 0,98 |
| 1:3 | 72,0 | 385,4 | 0,276 | 135,2 | 320 | 1,40 | 98,5 | 1,27 |
| 1:4 | 80,0 | 349,6 | 0,250 | 160,0 | 335 | 1,40 | 93,7 | 1,27 |
ход фермента не позволил в дальнейшем использовать эту соль для получения препарата Pen. Wortmannii BKMF 2091.
Из анализа вышеприведённых данных можно сделать вывод, что для осаждения препарата протеиназы целесообразно применение этанола и изопропанола. В зависимости от назначения препарата возможно применение этого или иного растворителя с практически одинаковым эффектом.
3.2 Фракционирование протеолитического комплексного
препарата ферментов.
Полученный осаждением органическими растворителями препарат нами назван „протовортманин Г10х”. В дальнейшем представляло интерес изучить его компонентный состав и идентифицировать протеолитические фракции. Для этого был использован метод дискового электрофореза в ПААГ. Электорофорез вели с учётом „нейтральной’’природы протеолитического комплекса.
Компонентный состав препарата представлен четырьмя фракциями, отличающимися подвижностью в электрическом поле, размерами и интенсивностью окраски белковых полос.
Идентификацию протеолитических фракций проводили двумя способами: насыщением ПААГ денатурированным гемоглобином (pH 7,2) после дискового электрофореза и последующим выявлением прогидролизованных участков; экстракцией белкового спектра из ПААГ дистиллированной водой с определением протеолитической активности в экстрактах.
При гидролизе гемоглобина в ПААГ обнаружены две протеолитические фракции, которые проявились в виде двух светлых полос. Это свидетельствовало о том, что комплекс ферментов, гидролизующий белки в нейтральной области pH сложен и представлен двумя фракциями. Аналогичными были данные при использовании метода экстракции белковых полос из геля.
Таким образом, используя методы дискового электофореза было установлено, что компонентный состав полученного препарата представлен четырьмя фракциями, две из которых протеолитические. Кроме активного протеолитического комплекса препарат „протовортманин Г10х” содержал в своём составе глюкоамилазу (ГЛА 20ед/г) и альфаамилазу (3ед/г), сопутствующие ферменты, а также баластные вещества. Для получения гомогенных протеолитических фракций необходимо ввести более глубокую очистку.
3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента.
Нами была поставлена цель определить рН и температурные оптимумы действия выделенных протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и дать их сравнительную характеристику.
Нужное значение рН субстрата поддерживали с помощью 0,1М универсального буфера. Гидролиз вели при температуре 30оС в течение 30 минут. Ферментативную активность определяли стандартным методом [12].
Как видно на рис.2, препарат проявляет определённую активность в широкой зоне рН. Однако максимум активности наблюдается при различных значениях рН. Протеиназа 1 имеет оптимальное значение рН 7,2, в то время как протеиназа 2 – 10,0. Таким образом, протеиназа 1 имеет нейтральную природу, а протеиназа 2 – щелочную.
Температурный оптимум действия ферментов определяли в интервале температур 30 – 80оС при оптимальных значениях рН 7,2 и 10,0. На рис.3 показано влияние температуры на активность ферментов. Для протеиназы 1 максимальный гидролиз наблюдается при температуре 60оС, а протеиназы 2 – 40оС.
Таким образом, протеолитический комплекс Penicillium wortmannii 2091 представлен двумя ферментами, имеющими различные температурные и рН – оптимумы.
 | ||
 | |