- видоизменение эластиновых волокон;
- разделение коллагеновых волокон на отдельные фибриллы.
Одним из направлений совершенствования процесса мягчения является использование ферментных препаратов, действующих в кислой среде, что даёт возможность объединить в один процесс мягчение и пикелевание. Мягчение в кислой среде способствует получению однородного грифа и текучести по всей площади кожи.
Из-за ряда существенных преимуществ, предпочтение отдаётся микробным препаратам. Среди них положительно опробированны препараты, полученные из грибов Aspergillus, бактерий Bacillus, актиномицетов [1,4].
В результате отбора микробных продуцентов авторами [5] предложены Penicillium wortmannii ВКМ – 2091 и Streptomyces chromogenes s.graecus 0832. Установлено, что Str. chromogenes наиболее кератинофилен, однако по уровню коллагеназной активности этот продуцент был ниже промышленного B. subtilis. Высоким уровнем коллагеназной и кератиназной активности при гидролизе пера отличаются протеолитические комплексы ферментов P. wortmannii, включающие две специфические протеиназы с различными физико-химическими свойствами, удовлетворяющие требованиям мясной промышленности [2].
Целенаправленное применение комплекса ферментов открыло перспективы к созданию принципиально нового подхода к обработке кишечного сырья для получения натуральной колбасной оболочки. При этом трудоёмкие процессы механической обработки возможно заменить применением ферментных препаратов.
Известно, что серозный слой, подлежащий удалению, включает жировые и белковые компоненты. Для их разрушения разработан в Московской государственной технологической академии пищевых производств и получен в опытно-промышленных условиях препарат путём высушивания культуральной жидкости Rhizopus oryzae.
Сравнительные гистологические исследования тканей кишечного сырья, обработанного механическим и ферментативным способами, показали полностью идентичную структуру. Однако в случае ферментативной обработки поверхность не деформирована, на ней полностью отсутствуют штрихи, порезы и другие механические дефекты.
Разработанное техническое решение имеет ряд преимуществ: полностью заменяется сложное электромеханическое оборудование по разрыхлению и удалению серозных слоёв (шляма), отсутствуют разрывы кишок, повышается качество сырья, улучшаются условия труда.
Основной задачей получения коллагеновых масс является максимальная очистка исходного сырья и выделение целевого продукта – коллагена – в свободном от примесей виде. В качестве ферментных препаратов используют прототерризин П10х (источник Asp. terricoba) или протосубтилин Г10х (источник Bac. subtilis). Способ характеризуется высокой степенью очистки исходного сырья от балластных компонентов под действием ферментов микробиального происхождения, их низкой себестоимостью, высокой степенью экологичности производства.
Сложность и трудоёмкость приготовления препаратов ферментов, потеря значительной доли коллагена в результате неполной его экстракции и денатурации под влиянием повышенной температуры, действующей длительное время, снижают значение методов обработки коллагена протеолитическими ферментами животного и растительного происхождения. Новые перспективы и реальная возможность внедрения биотехнологических методов в производство возникает при использовании микробных ферментных препаратов, отличающихся высокой стабильностью, возможностью варьировать специфику биохимических свойств. Было проведено изучение эффективности ферментативного гидролиза балластных компонентов различных коллагенсодержащих источников с применением ряда микробных препаратов: протосубтилина, протомегетерина, липоризина, выделенных из соответствующих микроорганизмов (B. subtilis, B. megaterium, R. oryzae).
Таким образом, для мясной промышленности наибольшую перспективу имеют микробные ферментные препараты и клетки, характерные специфической активностью в отношении фибриллярных белков упроченной структуры.
Оценка эффективности биотехнологий переработки коллагенсодержащего сырья предполагает экономию 10 – 20% основного сырья при получении полноценных мясных продуктов и 70 – 100% - в случае выработки искусственных оболочек и плёнок.
Применение специфических ферментных препаратов и клеток позволяет осуществить принципиально новые технологии глубокой и комплексной переработки основного, вторичного сырья и не пищевых отходов с реализацией режимов в естественных диапазонах температуры, рН среды и давления, минимальными энергозатратами, без дополнительных капитальных вложений и нежелательных экологических воздействий.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Определение величины рН.
Величину рН определяли потенциометрически на рН-метре ЛПУ-01. Для измерений значений рН растворов в температуре отличной от 20oС, применяли автоматическую компенсацию.
2.2 Метод определения протеолитической активности.
Протеолитическую активность (ПА) определяли по ГОСТ 20264.2-74 [12]. Субстратом служил 2% раствор казеината натрия, к которому добавляли 2см3 раствора фермента и помещали в ультратермостат при температуре 30oС. После проведения гидролиза в течение 10 минут в опытную пробирку приливали 4см3 раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживали ещё 20 минут при температуре 30oС. Затем фильтровали в сухие пробирки. К 1см3 фильтрата добавляли 5см3 0,5М раствора карбоната натрия, перемешивали и добавляли 1см3 рабочего раствора Фолина. Через 30 минут измеряли оптическую плотность раствора на ФЭКе КФК-2 при 670 нм в кюветах с поглощающим свет слоем 10 мм против контроля. За единицу ПА принимают такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30oС катализировало переход в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 ммолю тирозина (1ммоль тирозина равен 0,181мг).
2.3 Определение коллагеназной активности.
Коллагеназную активность определяли по содержанию оксипролина в смеси, образовавшегося в результате действия фермента на нативный коллаген. С этой целью готовили реактив для окисления: 28,2 г хлорамина Т растворяли в 40см3 воды для получения 0,05М концентрации, добавляли 60см3 ацитат-цитратного буфера с рН 6,0. К 2см3 анализируемой пробы, содержащей 2 - 20 см3 оксипролина, приливали 1мл реактива для окисления, встряхивали и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Затем в смесь вносили 2 – 1 см3 4М хлорной кислоты, встряхивали и через 5 минут приливали 3см3 10% раствора n-диметиламинобензальдегида в метилцеллосольфе. Пробу нагревали 15 минут в водяной бане при 150оС и после охлаждения фотометрировали с зелёным светофильтром на ФЭК-56М (555нм).
Гидролиз коллагена вели в следующих условиях: 20 мг нативного коллагена обрабатывали исследуемым ферментным препаратом в присутствии буферной системы с рН 7,0 так, чтобы общий объём составил 25см3. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37oС. Контролем служили пробы, инкубированные в тех же условиях, но без фермента, предварительно остановив реакцию внесением 0,5см3 этанола и центрифугированием смеси в течение 15 минут при 6000 ч×мин-1.
Активность коллагеназы выражали либо в ммолях оксипролина на 1 мг белка за 60 минут, либо в процентах растворения.
2.4 Определение молекулярной массы фермента.
Молекулярную массу определяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе У-100. Расчёт проводили по формуле:
LgM=5,941-0,847 (V/V0),
где V – объём выхода фермента;
V0 – свободный объём колонки.
2.5 Определение содержания аминного азота.
Метод основан на образовании цветного комплекса при взаимодействии аминогрупп аминокислот с гидроксидом меди. В пробирку, содержащую 100 мг сухого медного реактива, вносили 4см3 анализируемой пробы, предварительно нейтрализованной сухим бикарбонатом натрия, выдерживали 15 минут периодически встряхивая. Затем центрифугировали и измеряли оптическую плотность на ФЗКе КФК-2 при 590 нм. В контроле вместо 4см3 пробы присутствовало 4см3 дистилированной воды. Содержание аминного азота рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для известных аминокислот.
2.6 Электрофоретические исследования.
2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов.
Электрофорез проводили по методу Дэвиса на приборе фирмы Reanol (Венгрия) в щелочной буферной системе, рН 8,9. Концентрация акриламина в мелкопористом геле составила 5%. Длина мелкопористого геля в трубочке составила 5,5 см. Растворы для полимеризации готовили обычным способом. Исследуемый образец, содержащий 20 – 30 мкг белка смешивали в соотношении 1 : 1 с 40% раствором сахарозы и наносили на трубочку с гелем. Объём образца не превышал 0,2 см3. Поверх образца осторожно наслаивали электродный буфер, который содержал в 1 л 0,6 г трис-(гидроксиметил)-амино-метана и 2,88 г глицина.
В верхний резервуар прибора вносили 1 см3 0,001% раствора бромфенолсинего для контроля за движением фронта подвижных ионов. В первые 10 – 15 минут сила тока составила 1мА на трубочку, а затем 2,5мА. После окончания электрофоретического разделения гели вынимали из трубочек и проводили окрашивание. Окрашивание проводили раствором амидочерного с массовой долей 0,5, приготовленного с массовой долей 7 уксусной кислоты. Окрашивание проводили 20 – 30 минут. Краситель отмывали с массовой долей 7 уксусной кислотой с многократной сменой раствора.
2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ [16].
Для проявления в гелях полос с протеиназой их выдерживали в денатурированном растворе гемоглобина 2% концентрации в течение 15 – 30 минут при температуре 30oС. Затем промывали несколько раз дистиллированной водой и переносили в раствор амидочерного. Проводили окрашивание в течение 20 – 30 минут. Краситель отмывали 7% уксусной кислотой. Если в гелях присутствовала протеиназа, то появлялись белые полосы.