19)ступка диаметром 15 см;
20)технохимические весы на 200 г;
21)нож из нержавеющей или хромированной стали.
Установление титра краски по аскорбиновой кислоте (по С.М.Прокошеву). Метод установления титра краски основан на параллельном титровании раствора аскорбиновой кислоты краской и 0.001 н. раствором иодата калия. Так как 1 мл 0.001 н. раствора иодата эквивалентен 0.088 мг аскорбиновой кислоты, то легко рассчитать титр краски.
Перед установлением титра краски растворяют несколько кристалликов аскорбиновой кислоты приблизительно в 50 мл 2-процентной серной кислоты. 5 мл этого раствора титруют краской из микробюретки. Тотчас же после этого такой же объем раствора аскорбиновой кислоты титруют из другой микробюретки точно 0.001 н. раствором иодата с прибавлением в колбочку перед титрованием нескольких кристалликов (около 5-10 мг) иодистого калия и 5 капель 1-процентного раствора растворимого крахмала. Применение больших концентраций иодистого калия недопустимо, ибо при высоких концентрациях этой соли сильно тормозится оксисление аскорбиновой кислоты иодом.
Подготовка материала.
Среднюю пробу предварительно грубо измельчают ножом на стеклянной пластине, либо фарфоровой чашке. Необходимо помнить, что следы железа и меди катализируют разрушение витамина С. Весь процесс измельчения необходимо выполнить как можно быстрее.
Из измельченного и хорошо перемешанного материала берут на часовые стекла две параллельные навески на технохимических весах для определения аскорбиновой кислоты. При одновременном анализе нескольких образцов следует стремиться все навески для определения аскорбиновой кислоты сразу залить кислотой и после уже растирать до образования гомогенной смеси.
Ход определения.
Приготовление вытяжек.
Навеску исследуемого материала в 5-10 г заливают в ступке 20 мл 1-процентной соляной кислоты и быстро растирают в присутствии кислоты до образования гомогенной массы. Процесс растирания не должен длиться больше 10 минут. Полученную массу сливают из ступки (через стеклянную палочку и воронку) в мерную колбу на 100 мл. Ступку споласкивают несколько раз 2-процентной метафосфорной кислотой, которую выливают в ту же мерную колбу. Содержимое колбы доводят до метки 2-процентной метафосфорной кислотой, колбу закрывают пробкой, сильно встряхивают и оставляют стоять около 5 минут. Затем содержимое колбы выливают на сухой фильтр и отфильтровывают часть экстракта (около 50 мл) в сухой стакан или колбу.
Соляная кислота извлекает из растительной ткани как свободную, так и связанную аскорбиновую кислоту. Метафосфорная же кислота осаждает белки и улучшает стойкость аскорбиновой кислоты в экстрактах.
Метафосфорная кислота не извлекает связанной аскорбиновой кислоты из тканей. Поэтому если хотят определить отдельно свободную форму аскорбиновой кислоты, то экстракцию материала производят одной только 2-процентной метафосфорной кислотой. По разности же между результатами титрования экстрактов, полученных путем использования для экстракции смеси соляной и метафосфорной кислот и одной метафосфорной килоты, узнается количество связанной аскорбиновой кислоты.
Определение аскорбиновой кислоты в окрашенных вытяжках (по И.К. Мурри).
Многие растительные материалы дают окрашенные экстракты, что затрудняет определение аскорбиновой кислоты путем прямого титрования краской (2,6-дихлорфенолиндофенолом). При анализе таких объектов аскорбиновую кислоту в экстракте окисляют краской, прибавляя значительный избыток ее. Избыток краски извлекают из экстракта таким растворителем, который сам не растворим в воде, растворяет краску и не растворяет пигментов экстракта. По разности между количеством прибавленной к экстракту краски и ее остатком после реакции (определенном колориметрически) узнают какое количество краски идет на окисление аскорбиновой кислоты.
Ход определения
10 г исследуемого материала экстрагируют 2-процентной метафосфорной кислотой и доводят объем экстракта кислотой до 100 мл. После фильтрования берут градуированный пипеткой определенный объем окрашенного экстракта и наливают в мерный цилиндр. Туда же наливают 2 мл 0.001 н. раствора краски и хорошо перемешивают. Через 2 минуты приливают пипеткой 10 мл. смеси толуола и изобутилового спирта, закрывают цилиндр пробкой и осторожно взбалтывают опрокидыванием его в руках 8-10 раз. Оставляют в покое до полного разделения слоев. Избыток краски переходит в верхний слой и окрашивает его в красный цвет (в темном месте интенсивной краски не изменяется в течение нескольких часов). Часть раствора наливают в колориметрическую пробирку и колориметрируют. Для удобства наливания лучше удалить шариковой пипетко из цилиндра водный, нижний, слой. Раствором сравнения, наливаемым в другую колориметрическую пробирку, служит раствор краски, который приготовляется так же, как опытный раствор, с той лишь разницей, что вместо растительного экстракта берут равный объем щавелевой или метафосфорной кислоты, которой пользовались при экстрагировании исследуемого материала.
Определение дегидроаскорбиновой кислоты.
Дегидроаскорбиновая кислота в небольшом количестве обнаружена во многих растениях, ее наличие связано с физиологической ролью витамина С в растительных тканях. При обычной оценке растительного сырья по содержанию витамина С можно ограничиваться определением восстановленой формы аскорбиновой кислоты ввиду незначительного содержания дегидроаскорбиновой кислоты. Дегидроаскорбиновая кислота может образовываться в довольно значительных количествах во время слишком длительнго растирания и измельчения растительной ткани переда анализом благодаря соприкосновению с атмосферным кислородом и активности окислительных ферментов.
Так как дегидроаскорбиновая кислота не титруется 2,6-дихлорфенолиндофенолом, то она может быть определена только после восстановления ее в аскорбиновую кислоту.
Принцип метода
Сначала определяют в растительном экстракте описанным выше методоа содержание восстановленой аскорбиновой кислоты. Затем в том же экстракте дегидроаскорбиновую кислоту восстанавливают в аскорбиновую кислоту сероводородом и снова определяют общее содержание восстановленой аскорбиновой кислоты. По разности между вторым и первым определениями узнается количество дегидроаскорбиновой кислоты в экстракте.
При определении всех формы аскорбиновой кислоты (свободной, связанной и дегидро-формы) количество фильтрата 100 мл может оказаться недостаточным, в таком случае следует увеличить величину навески и объем экстракта, сохраняя их изначальное соотношение.
Ход определения.
Наливают в стакан 50 мл. профильтрованного растительного экстракта. Через экстракт пропускают сероводорода в течение 20 минут (работа ведется в вытяжном шкафу). Сероводород должен проходить через экстракт непрерывно. Затем для удаления сероводорода через экстракт пропускают углекислоту. Полноту удаления сероводорода через экстракт контролируют уксусно свинцовой бумажкой, почернение которой указывае на наличие сероводорода. После полного удаления сероводорода экстрак, если он мутный, фильтруют, а при наличии центрифуги – центрифугируют. Затем берут две параллельные порции экстракта по 10 мл и титруют краской как обычно.
Если необходимо определить количество титруемых краской посторонних примесей, то к другим 2 параллельным порциям по 10 мл прибавляют 0.1 мл 10-процентного раствора сернокислой меди, нагревают 10 минут при 110 градусах, охлаждают и титруют краской. Полученную поправку вычитают из результата первого титрования и узнают сумму восстановленной и дегидроаскорбиновой кислоты в мг%. По разности между этой величиной и количеством мг% восстановленой формы аскорбиновой кислоты (определенно до обработки сероводородом) узнается количество дегидроаскорбиновой кислоты.
Определение активной кислотности
Биологическое значение активной кислотности.
Биологическое значение концентрации водородных ионов в растительных тканях очень велико. Многие ферментативные процессы в растениях регулируются реакцией среды, которая создается в результате поступления и образования различных веществ (минеральных солей, органических кислот). Скорость различных биохимических процессов управляется активной кислотностью среды.
Культурные растения и их сорта в процессе своего формирования (как биологических особей) приспособились к определенной активности кислотности почвы. Например, местные сорта, сложившиеся в результате длительного возделывания на кислых почвах слабо реагируют на известкование почв, тогда как сорта, сформировавшиеся (в условиях разделывания) на нейтральных почвах, сильно реагируют на известкование кислых почв.
Точный метод определения концентрации водородных ионов может быть использован не только для характеристики культур и соротов, но и в качестве биохимического метода контроля над происходящими изменениями в растительных материалах в процессе их переработки. Например, в соке свежеполученной мезги корнеплода свеклы был получен рН 6.00, по истечении же четырех часов хранения мезги в отжатом из нее соке был найден рН 6.30. В измельченных листьях шпината и подсолнечника также наблюдаются сдвиги в нейтральную и щелочную сторону. В неизмельченных листьях происходят другие изменения в концетрации водородных ионов, чем в измельченных. По характеру и быстроте сдвигов в концентрациях водородных ионов можно судить о сортовых различиях.
Поскольку эти различия связаны с характером окислительно-восстановительных и других процессов, то определение рН дает возможность быстро установить происходящие изменения. Таким образом, определение рН может служить для контроля.
Следует также подчеркнуть большое значение определении рН для различных биохимических процессов, например, при определении ферментов, витаминов и в других анализах.