SС- секреторный компонент; j- соединяющая; H-тяжелые; L-легкие цепи
В нормальной человеческой сыворотке найдены два антигенно различающихся подкласса IgA - А1 и А2 (Vaerman, Hereman, 1966, Kunkel, Prentergast, 1966, Feinstein, Franklin, 1966, Fomasi, Yrey, 1972). IgA2 существует в виде димеров, соединенных дисульфидной связью, а тяжелые и легкие цепи связаны нековалентными связями (Yrey et al, 1968, Незлин, 1982). Оба подкласса IgA обладают активностью антител (Dorrington, Fanford, 1970, Бернет, 1971). Молекулы IgА, содержащиеся в различных секретах - молоке, молозиве, пищеварительных соках, слюне, моче и т.д., имеют константу седиментации 11S и содержат дополнительную полипептидную цепочку- секреторный компонент с молекулярной массой 50 000 - 60 000 (Brandt et al, 1968, 1975, Fomasi et al, 1965, 1968).
Иммуноглобулины А слюны и пищеварительного тракта устойчивы к действию протеолитических ферментов - пепсина и трипсина (Ballierex et al, 1969, Porter, Noakes, 1970). Эта резистентность связана с присутствием секреторного компонента синтезированного в выделяющей секрет железе и затем присоединенного к молекуле IgA с образованием димеров из двух его молекул (Стефани, 1973, Чернохвостова, 1974, Першин, 1980).
Поэтому в секретах IgA обычно находится в виде димеров или тримеров Гаврилова , 1976). Мономеры IgА имеют молекулярную массу 160 000. IgА у некоторых видов животных имеет более высокую электрофоретическую подвижность, чем IgМ. Содержание углеводов высокое -10%. Молекулярная масса в основном, одинакова с IgG1, а у некоторой части популяции молекул IgA она промежуточная между IgA и IgM. Как и у других иммуноглобулинов, восстановление приводит к распаду молекулы на тяжелые и легкие цепи. Характерны тяжелые цепи.
IgA в сыворотке крови человека содержится в относительно большем количестве, чем IgМ и составляет около 19% от общего количества иммуноглобулинов (Hobby, 1971). В сыворотке крови многих видов животных, в частности овец и крупного рогатого скота, IgM преобладает над IgA. Значительное количество этого белка обнаружено в лимфе, где концентрация его в 2-18 раз выше, чем в крови (Стефани, 1971). Антитела найдены и в содержимом кишечника и фекалиях, 80% которых приходится на долю IgА. Антитела, выделяющиеся в кишечник в устойчивой к гидролизу форме, играют важную роль в защите организма от кишечных инфекций (Fomsi, Yrey, 1972). IgА находится на поверхности слизистых оболочек и активно участвует в местной иммунологической защите (Герберт, 1974).
г) Иммуноглобулины класса D. IgD также изучен недостаточно. Впервые он охарактеризован как четвертый класс иммуноглобулинов D.Rowe, G.Fahey (1965). Его молекулярная масса около 180000. Молекула IgD состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками (Vunnar, Fohansson, 1969, Spiegelberg, 1977, Ruddick, Leslie, 1977). Роль в организме человека почти не изучена. Полагают, что он - секреторный иммуноглобулин. Сывороточный IgD обнаружен только у человека и приматов. При электрофорезе в агаровом геле подвижность IgD соответствует подвижностямb и a глобулинов. Точных экспериментальных данных о присутствии IgD у животных пока не имеется.
д) Иммуноглобулины класса Е. IgE впервые идентифицирован K. Ishisaka, F. Fshisaka (1966). Молекулярная масса IgЕ 190 000, константы седиментации 8 S. Молекула IgE также состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, молекулярная масса которых 22 600 и 72 500 соответственно. Содержание углеводов свыше 12% (Шаханина, Стоев, 1981). IgE играют важную роль в патогенезе аллергии (Isgizaka, Ishizaka, 1976, Dorrington, Bennich, 1978). К.Г.Стоев (1979) разработал методы выделения и количественного определения D и Е иммуноглобулинов в сыворотке крови здоровых и больных людей.
ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Для выделения иммуноглобулинов из сыворотки крови животных, особенно G1, М и А, применяют различные методы получения предварительно очищенных белков, обогащенных соответствующими иммуноглобулинами. Дальнейшую очистку проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- сефадексе А-50, ДЭАЭ- целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацией на сефедексе G-200 или препаратным электрофорезом.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОЧИЩЕННЫХ
ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
С этой целью обычно применяют методы предварительного выделения иммуноглобулинов.
ОСАЖДЕНИЕ 4 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА АММОНИЯ
4 М раствором сульфата аммония осаждаются все белки сыворотки, включая альбумин.
В этой фракции, содержится основная масса иммуноглобулинов G1 и G2 и значительное количество IgМ и IgА , хотя последние обычно обнаруживаются и в надсадочной жидкости. Поэтому осадок, полученный 4 Мраствором сульфата аммония, может служить источником приготовления всех классов иммуноглобулинов, что имеет большое значение, особенно для выделения их из одной пробы сыворотки.
ОСАЖДЕНИЕ 2,78 М РАСТВОРОМ АММОНИЯ
К холодной сыворотке крови добавляют равный объем холодного 2,78 М раствора сульфата аммония, перемешивают при 40С2 ч. Сладок растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждают еще 2 раза. При этом 2,78 М раствором сульфата аммония в основном осаждаются иммуноглобулины класса G. Причем , такая концентрация соли осаждает IgG2 и , что очень важно,наиболее полно IgG1 при минимальном осаждении фракций a-и b-глобулинов. Поэтому данный метод наиболее удобен для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 как из сыворотки крови лошадей, так и овец и крупного рогатого скота.
ОСАЖДЕНИЕ 1,39 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА
АММОНИЯ ПУТЕМ ДИАЛИЗА
Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке помещают в 1,39 М раствор сульфата аммония, перемешивают в холодильнике магнитной мешалкой 2 суток при трехкратной смене раствора соли. Осадок дважды промывают 1,39 М раствором аммония.
При этом из сыворотки крови овцы и крупного рогатого скота осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, однако иммуноглобулин G1, a- и b- глобулины присутствуют лишь в следовых количествах. Из сыворотки крови лошадей, главным образом выделяетсяиммуноглобулин G2, IgG(Т) присутствует лишь в небольшом количестве.
Таким образом, препарат получаемый 1,39 М раствором сульфата аммония путем диализа удобен для выделения IgG2из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, однако наиболее чистый IgG2 получается из сыворотки крови лошадей.
ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ
К охлажденной сыворотке крови по каплям добавляют холодный 2,53 М раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1 М. Перемешивают 2 час в холодильнике, осадок растворяют и диализируют. 1 М раствором сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, практически свободные от фракции b-глобулинов. По нашим данным, этот метод достаточно прост и выгоден для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота. Недостаток метода в том, что такая концентрация соли не обеспечивает полного осаждения иммуноглобулина G1. По составу, препарат, выделяемый сульфатом натрия, идентичен препарату, получаемому 1,39 М раствором сульфатом аммония, поэтому он наиболее пригоден для выполнения иммуноглобулина G2.
ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50
Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50 типа средний (100-200 меш). Предварительную обработку и регенерацию ДЭАЭ -сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным буфером, рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с незначительными изменениями (Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).
Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле,где в зоне g -глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные g -глобулиновые фракции - IgG1 и IgG2, а иммуноэлектрофорезом, - три линии преципитации - IgG1, IgG2 и IgM. Таким образом, применив метод J.Baumstark et al (1964) не получили чистые фракции IgG1 и IgG2 из сыворотки крови овец и крупногорогатого скота, а только их смесь.
Следует подчеркнуть, что указанные авторы разработалиспособ выделения чистого IgG из нормальной сыворотки крови человека, испольэуя ДЭАЭ -сефадекс А-50 типа грубый и 0,01 М калий- фосфатный буфер рН, 6,5 . Однако З.С. Сеитов и Ж.Ж.Жумашев (1966) этим методом не смогли выделить иммунохимически чистый иммуноглобулин G2 из сыворотки крови лошадей. Им удалось выделить смесь белков состоящую из IgG2 и IgМ и IgА. Аналогичные результаты получены при выделении IgG2 из из нормальной сыворотки овец (Ж.Ж.Жумашев, З.С.Сеитов, 1968 а, б).
Результаты, отличные от результатов Baumstark et al (1964), по-видимому , обусловлены особенностями белковогосостава сыворотки крови этих видов животных. Таким образом,указанныйметод - также способ предварительного выделения IgG2 из нормальной сыворотки крови.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключение необходимо отметить, что американскому биохимику G.Edelman (1972) и английскому биохимику К.РогIgг (1972), работающим в области изучения человеческих иммуноглобулинов была присуждена Нобелевская премия 1972 года. Присуждение Нобелевской премии указывает на большое внимание мировой научной общественности к иммуноглобулинам и на достижение определенных успехов з изучении иммуноглобулинов человека.
Что касается иммуноглобулинов сельскохозяйственных животных, то, к сожалению, многие вопросы выделения, идентификации и количественного определения этих защитных белков остаются еще слабо разработанными.
Главный защитный белок сельскохозяйственных животных IgG. Причем он существует в виде двух подклассов: G1 и G2, которые различаются аминокислотным составом, электрофоретической подвижностью, антигенным и биологическим свойствам. Однако выделение из сыворотки крови чистых препаратов IgG1 - очень сложная, и следовательно, не до конца решенная проблема.
Поэтому большинство литературных данных по этому вопросу касается IgG и лишь немногие IgG1 и IgG2.
IgM один из высокомолекулярных и сложноорганизованных белков сыворотки крови, состоящий из 5 субъединиц, соединенных лабильными дисульфиными связями. Этим и объясняется трудность его выделения и изучения. Хотя существуют несколько современных методических приемов, помогающих его выделению, ни один из них в отдельности не обеспечивает получения чистого IgМ. Поэтому необходимо использовать комбинированные методы, основанные на особенностях его физико-химических свойств.