Для визначення концентрації речовини методом порівняння оптичних густин стандартного і досліджуваного розчинів беруть аликвотну частину досліджуваного розчину, наготовлюють з неї забарвлений розчин для фотометрування і вимірюють його оптичну щільність. Потім аналогічно наготовлюють 2–3 стандартних пофарбованих розчини обумовленої речовини відомої концентрації і вимірюють їхній оптичні щільності при тій же товщині шаруючи (у тих же кюветах).
Значення оптичної щільності досліджуваного розчину дорівнює:
Ах = ελCxlx
Значення оптичної щільності стандартного розчину дорівнює:
Аст = ελСстlст
Розділивши одне вираження на інше одержимо:
Ах/Аст = ελCxlx/(ελСстlст)
Тому що lх = lст, ελ = const, то
Сх = СстАх/Аст
Метод порівняння застосовують при однократних визначеннях; він вимагає обов'язкового дотримання основного закону світлопоглинання.
Існує й інший більш точний спосіб визначення невідомої концентрації Сх, називаний методом обмежуючих розчинів. Наготовлюють два стандартних розчини з концентраціями C1 і С2 так, щоб оптична щільність першого з них A1 була б менше оптичної щільності Ах досліджуваного розчину, а оптична щільність А2 другого стандартного розчину була б, навпаки, більше, ніж Ах.
Невідому концентрацію досліджуваної речовини розраховують по формулі:
Cx = C1 + (C2 – C1)(Ax – A1)/(A2 – A1)
Для фотометричних вимірів використовують дві великі групи приладів: фотоколориметри і спектрофотометри.
У колориметрах потрібні спектральні діапазони виділяються за допомогою світлофільтрів, що обмежують ділянки спектра, у яких можуть проводиться виміри. У спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм чи дифракційних ґрат, що дозволяє встановлювати будь-як довжину хвилі в заданому діапазоні.
Конкретна послідовність операцій при вимірі оптичної щільності чи пропускання залежить від конструкції чи спектрофотометра колориметра.
Однак основні принципи залишаються незмінними. Спочатку встановлюють необхідну довжину хвилі, вибираючи світлофільтр на колориметрі чи обертаючи відповідну рукоятку на спектрофотометрі. Потім установлюють нуль. Для цього у світловий потік поміщають кювету зі стандартним розчином. Змінюючи ширину щілини, домагаються того, щоб показання приладу відповідали величині, передбаченою інструкцією. На наступному етапі стандартний розчин заміняють досліджуваним і роблять відлік величини оптичної щільності чи пропускання.
Фотоелектроколориметр – це оптичний прилад, у якому монохроматизация потоку випромінювання здійснюється за допомогою світлофільтрів.
Сучасні спектрофотометри дозволяють працювати з високомонохроматизированим потоком випромінювання. Вони застосовуються для концентраційного аналізу і при вивченні спектрів поглинання речовин.
Структурну схему спектрофотометра можна представити у виді наступних основних блоків:
- джерело світла,
- монохроматор,
- кюветне відділення,
- фотоелемент,
- пристрій, що реєструє.
Світловий пучок від джерела світла попадає в монохроматор через вхідну щілину і розкладається дифракційними ґратами чи призмою в спектр. У монохроматичний потік випромінювання, що надходить з вихідної щілини в кюветное відділення, по черзі вводяться контрольний і досліджуваний зразки. Випромінювання, що пройшло через кювету, попадає на фотоелемент, що перетворює світлову енергію в електричну. Електричний сигнал потім підсилюється і реєструється.
Монохроматор – це оптична система, що виділяє з усього спектра джерела світла випромінювання визначеної довжини хвилі. Це звичайно призми, що по-різному переломлюють світло різних довжин хвиль, чи дифракційні ґрати. У видимій області використовуються звичайні скляні призми, але в ультрафіолетовій області вони не годяться, оскільки скло починає поглинати вже при λ < 400 нм, тому призми роблять із кварцу.
Як монохроматори застосовуються також дифракційні ґрати, що являють собою плоскопаралельну пластину з нанесеними на ній рівнобіжними лініями – борозенками. Біле світло через дифракцію на рівнобіжних борозенках розкладається на безупинний спектр. Звичайно в монохроматорах спочатку виділяють пучок світла з визначеним діапазоном довжин хвиль за допомогою призми, а потім розкладають його ще раз ґратами. Так одержують строго монохроматичне світло. Основне достоїнство дифракційних ґрат полягає в тому, що можна збільшувати їхню здатність, оскільки вона прямо пропорційна щільності ліній. Крім того, у всьому діапазоні довжин хвиль дифракційні ґрати мають лінійну роздільну здатність, тоді як роздільна здатність призменного монохроматора зі збільшенням довжини хвилі зменшується.
Досліджувану речовину розчиняють у відповідному розчині і поміщають в оптично прозору судину для вимірів – кювету. Звичайно кюветотримач має осередку для чотирьох кювет. Оскільки стекло поглинає ультрафіолетове світло, для проведення вимірів в ультрафіолетовій області спектра використовують кварцові кювети. Для вимірів у видимій області можна використовувати пластикові чи скляні кювети. При роботі з леткими чи хімічно активними речовинами кювети закривають кришками.
Оскільки кювета, поміщена в спектрофотометр, стає складовою частиною його оптичної системи, з нею потрібно поводитись дуже акуратно. Подряпини і бруд на стінках кювети сильно розсіюють і поглинають світло, спотворюючи результати вимірів. Про цьому особливо треба пам'ятати при роботі в ультрафіолетовій області. Кювети можна протирати м'якими тканинами, наприклад, з бавовни. Не рекомендується використовувати для цих цілей фільтрувальний папір. Оскільки органічні молекули поглинають в ультрафіолетовій області, ні в якому разі не можна торкатися оптичних (прозорих) стінок кювети. Розчин краще заливати в кювету, поставивши її в попередньо вийнятий із приладу кюветотримач. Кювети досить тендітні, особливо кварцові, тому працювати з ними треба обережно, не допускаючи механічних ушкоджень.
Уміст кювети повинний бути гомогенним – це необхідна умова одержання відтворених даних. Потрібно стежити за тим, щоб розчин не був мутним. Особливо заважають вимірам пухирці повітря, що сильно збільшують розсіювання. Не можна наливати в кювету дуже холодний розчин, оскільки при цьому на зовнішніх стінках кювети конденсуються пари води повітря, і стінки стають непрозорими.
Якщо кювети забруднені сторонніми домішками, їх варто промити дистильованою водою і (чи) розчинником, у якому розчинена досліджувана речовина. Кювети можна мити м'якими детергентами. Не рекомендується мити кювети концентрованими кислотами чи лугами, а також іншими агентами, що отруйні.
Кювети потрібно заповнювати до такого рівня, щоб потік випромінювання проходив цілком через шар розчину. Найчастіше використовуються кювети з оптичним шляхом 1 см, у які звичайно заливають 2,5–3 мл розчини. У такі кювети входить 4–5 мл, але заповнюють їхній цілком лише в тому випадку, коли це необхідно. Є кювети з оптичним шляхом 50, 20, 5, 2 і 1 мм.
Фотоелементи перетворюють світлову енергію в електричну. Електричний сигнал потім підсилюється і реєструється.
Фотони, бомбардуючи поверхню фотоелемента, вибивають з нього електрони, кількість яких пропорційно інтенсивності світла. Ці електрони летять до позитивного електрода. У результаті в замкнутому ланцюзі виникає електричний струм, що реєструється по спаданню напруги на опорі, що знаходиться в цьому ланцюзі. Напругу можна підсилити, і після компенсації такого сигналу потенціометром, відградуюванним в одиницях поглинання, на датчику реєструється безпосереднє поглинання зразка.
Фотомножники звичайно більш чуттєві, чим прості фотоелементи.
Це відбувається через те, що електрони, що вилетіли з фоточуттєвого шару, прискорюються високою напругою, а через зіткнення в газі виникають вторинні електрони, що і приводить до зростання струму.
Від розміру щілини залежить діапазон довжин хвиль світла, що падає на зразок. Тому для одержання надійних результатів треба працювати при мінімально вузькій для даних умов експерименту щілини. Якщо щілина обрана правильно, то при зміні її розмірів удвічі показання приладу не міняються.
Звичайно нульове значення поглинання встановлюють щілиною, але в гарних спектрофотометрах це роблять, змінюючи напругу фотоелемента. Таке регулювання дозволяє працювати при постійній ширині щілини.
При визначенні концентрації речовини в розчині за допомогою каліброваного графіка слід дотримуватися наступної послідовності:
- вибрати світлофільтр;
- вибрати кювету;
- побудувати градуювочну криву;
- вимірити оптичну щільність досліджуваного розчину і визначити його концентрацію, використовуючи градуювочну криву.
Наявність у колориметрі вузла світлофільтрів і набору кювет дозволяє підібрати таке їхнє сполучення, при якому погрішність у визначенні концентрації буде мінімальною.
Якщо спектральні характеристики забарвленої речовини невідомі, світлофільтр для роботи можна вибрати самостійно. У видимій частині спектра сприйманий колір є результат виборчого поглинання визначеної ділянки спектра білого світла. Колір розчину є додатковим до кольору поглинання випромінювання. Тому вимір поглинання варто проводити в додатковій для кольорової реакції області спектра. Так, якщо розчин забарвлений у синьо-зелений колір, те потрібно вимірювати поглинання цим розчином червоного кольору.