Виробництво генно-інженерного інсуліну людини Оптимізація умов ферментативного гідролізу п (стр. 1 из 2)

Назва реферату: Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві
Розділ: Біологія

Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві

У Російській Федерації, як і в усьому світі, постійно збільшується кількість хворих цукровим діабетом і в цей час воно досягає 2 млн. чоловік, з яких більше 400 000 мають потребу в щоденному прийомі інсуліну.

Проблема забезпечення хворих цукровим діабетом препаратами інсуліну особливо загострилася з 1990 року після припинення виробництва ряду готових лікарських форм інсуліну через невідповідність їхньої якості світовому стандарту й заборони використання яловичих інсулінів, що становили 70 відсотків об'єму випуску.

В останні роки більшість розвинених країн світу для лікування хворих цукровим діабетом використовують рекомбінантний інсулін людини, одержуваний генно-інженерними методами. В 2005 р. на закупівлю інсуліну Росія затратила 185 млн. дол. США. Реальним шляхом, що дозволяє покрити дефіцит інсуліну й знизити витрати валютних коштів, є створення в країні потужностей по виробництву вітчизняного рекомбінантного інсуліну людини.

Інсулін відноситься до життєво важливих лікарських засобів, які Всесвітня організація охорони здоров'я рекомендує самостійно виробляти тим країнам, чиє населення перевищує 50 млн. чоловік. З 1923 року до 80-х років минулого століття інсулін вироблявся винятково із тваринної сировини, а саме з підшлункової залози свиней і великої рогатої худоби, і тільки в 1982 році вперше була створена можливість виробництва інсуліну людини методом генетичної зміни мікроорганізмів. У цей час частка генно-інженерного інсуліну людини в усьому світі неухильно зростає й в 2004 р. вона склала більше 70% від загального обсягу виробництва гормону.

Структура людського інсуліну

Молекула інсуліну являє собою поліпептид, що складається із двох ланцюгів - А и В (мал. 1);

Мал. 1. Структура інсуліну й розбіжності в амінокислотній послідовності молекул інсуліну ссавців. Сірим кольором показані місця замін амінокислот, що найбільш часто зустрічаються.

Ланцюги інсуліну ковалентно зв'язані між собою двома дисульфідними зв'язками АЗ7 і АЗ19. У молекулі інсуліну є також один дисульфідний зв'язок в А-ланцюга: А6-АН . Амінокислотна послідовність інсуліну людини й більшості ссавців добре відома . Локалізація всіх трьох дисульфідних містків постійна, а А- і У-ланцюга представників більшості видів містять 21 і 30 амінокислотних залишків, відповідно. В обох ланцюгах у багатьох положеннях зустрічаються амінокислотні заміни, що не впливають на біологічну активність гормону, однак найпоширенішими є заміни в положенні 8.9 і 10 А-ланцюга (табл. 1).

Таблиця 1:Амінокислотна послідовність інсуліну різних ссавців

Ссавці	Амінокислоти А-ланцюга в положенні			Амінокислоти У-ланцюга в положенні
8	9	10	30
Людина	Треонін	Серин	Ізолейцин	Треонін
Бик	Аланін	Серин	Валіи	Аланін
Свиня	Треонін	Серин	Ізолейцин	Аланін
Собака	Треонін	Серин	Ізолейцин	Аланін
Кашалот	Треонін	Серин	Ізолейцин	Аланін
Кролик	Треонін	Серин	Ізолейцин	Серин
Кит	Аланін	Серин	Треонін	Аланін

Із цього слідує, що дана ділянка, швидше за все, не має вирішального значення для біологічної активності інсуліну.

Деякі структури молекули інсуліну мають високу консервативність. У їхньому числі положення трьох дисульфідних містків, гідрофобні залишки в С-кінцевій ділянці В-ланцюга й С- і N-кінцеві ділянки А-ланцюга.

Використання хімічних модифікацій і замін окремих амінокислотних залишків у цих ділянках допомогли ідентифікувати структуру активного центра інсуліну. Розташована на С-кінці В-ланцюга гідрофобна ділянка бере участь також у димеризації інсуліну.

Цинк, концентрація якого в β-клетках острівців Лангерганса досягає високих значень, формує комплекси з інсуліном. Інсуліни всіх хребетних утворюють димери за допомогою водневих зв'язків між пептидними групами залишків В24 і В26 двох мономерів, які при високих концентраціях гормону, у свою чергу, реорганізуються в гексамери, що містять по два атома цинку в кожному. Наявність таких высоковпорядкованих комплексів істотно полегшило вивчення кристалічної структури інсуліну. При фізіологічних концентраціях інсулін перебуває в мономерній формі.

Одержання генно-інженерного інсуліну людини.

В 1980 р. американськими вченими Міллером і Бакстером був уперше описаний процес клонування людського гена в Е. coli з наступною індукцією й одержанням білка, ідентичного людському . Цим білком був інсулін людини.

У промислових умовах рекомбінантний інсулін уперше отриманий американською фармацевтичною компанією Eli Lilly разом з біотехнологічною компанією Genentech (США). Перший ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ ІНСУЛІН ЛЮДИНИ надійшов на фармацевтичний ринок в 1982 р.

У цей же час компанія «Novo-Nordisk» (Данія) розробила технологію одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ, засновану на використанні генетично модифікованих дріжджових культур у ролі суперпродуцентів інсуліну людини. Використання еукаріот, що мають подібну з людською систему процессінгу білків, у ролі продуцентів інсуліну дозволило одержати гормон або його попередника в нативній формі. Значною перевагою даної технології є повна відсутність у препараті бактеріальних ендотоксинів і пірогенів клітинної стінки. Незважаючи на всі ці переваги одержання інсуліну з використанням бактеріальних штаммів-суперпродуцентів залишається кращим завдяки більше високому рівню експресії інсуліну в складі гібридного білка.

У цей час генно-інженерний інсулін виготовляють шляхом ферментації генетично змінених мікроорганізмів (кишкової палички, дріжджів), які здатні синтезувати попередник інсуліну (проінсулін) у складі химерного протеїну. З отриманого біосинтетичним шляхом проміжного продукту ензиматичним шляхом реконструюють інсулін людини. Виробнича схема процесу наведена в табл. 2 .

Таблиця 2: Принципова схема виробництва ГЕНО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ

№ стадії	Технологічний процес
1	Культивування штаму Е. coli з вбудованим геном гібридного білка, що включає повну послідовність інсуліну людини
2	Очищення й ренатурація ГБ
3	Протеолітичне розщеплення ГБ с одержанням інсуліну
4	Очищення інсуліну

Дана схема багато в чому нагадує процес біосинтезу інсуліну в острівцях Лангерганса, де гормон спочатку з'являється у вигляді білка-попередника (проінсулину), а потім протеолітичними ферментами від проінсулину відщеплюється сполучний С-пептид у спеціальних везикулах. У виробництві для розщеплення ГБ використають подібні по специфічності ферменти: трипсин і карбоксипептидазу В. Гідроліз проводять шляхом обробки ферментами послідовно або одночасно.

Сучасне виробництво генно-інженерного інсуліну людини в Росії.

В 1996 році в Російській федерації прийнята цільова федеральна програма «Цукровий діабет», що передбачає створення виробничих потужностей по виробництву генно-інженерного інсуліну людини. У рамках цієї роботи вчені з ВАТ «Національні біотехнології» (п. Оболенськ, Московська область) при участі співробітників Інституту біоорганічної хімії (ІБХ) РАН і Державного інституту кровозамінників і медичних препаратів за 4 роки спільної роботи створили штам-продуцент гібридного білка Е. coli JM109/pPINS07 і лабораторну методику одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ. Була проведена перевірка якості отриманого препарату й лікарських форм на його основі й підготовлене технічне завдання на проектування лінії потужністю 5-10 кг субстанції інсуліну в рік.

На основі цих розробок ВАТ «Національні біотехнології» в 2003 р. була введена в експлуатацію дослідно-виробнича лінія по випуску субстанції ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ потужністю 10 кг/рік . Дана лінія відповідає вимогам для генетично-модифікованих продуктів Європейського Союзу й робить ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ ІНСУЛІН ЛЮДИНИ, що відповідає всім основним показникам якості у міжнародних фармакопеях. Принциповий технологічний процес виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на підприємстві ВАТ «Національні біотехнології» представлений у табл. 3.

Таблиця 3: Технологічна схема виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на ВАТ «Національні біотехнології»

№ стадії	Технологічний процес
1	Культивування штаму-продуцента Е. coli JM109/pPINS07
2	Руйнування клітин
3	Відділення осаду ГБ-сирцю центрифугуванням
4	Розчинення ГБ з одночасним відновленням нерегулярних S-S-зв'язків
5	Ренатурація ГБ з утворенням правильних S-S-зв'язків
6	Хроматографічне очищення ГБ на іонообмінному сорбенті (КМ-сефароза)
7	Гідроліз ГІБРИДНИЙ БІЛОК трипсином (одержання диаргинининсулина)
8	Хроматографічне очищення діаргінінінсуліну на іонообмінному сорбенті (SP-Sepharose FF)
9	Концентрування фракцій, що містять 90% діаргінінісуліну
10	Трансформація ДАІ карбоксипептидазою В (одержання первинного інсуліну)
11	Очищення первинного інсуліну методом фазової ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ до чистоти >96%
12	Хроматографічне очищення ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУЛЮДИНИ від високо- і низькомолекулярних домішок за допомогою гель-фільтрації
13	Кристалізація й перекристалізація інсуліну в присутності іонів Zn+2
14	Сушіння кристалів Zn-інсуліну

Метод заснований на технології так названого «роздільного гідролізу», при якому ГБ піддається спочатку розщепленню трипсином з одержанням основного продукту — діаргінінісуліну , а потім ДАІ піддається хроматографічному очищенню, концентруванню й трансформації в первинний інсулін із чистотою не менше 92—96%.