Виробництво генно-інженерного інсуліну людини Оптимізація умов ферментативного гідролізу п (стр. 2 из 2)

При такій послідовності проведення технологічного процесу порівняно нескладно очистити ДАІ від домішки дезтреонінінсуліну (інсуліну, у якому відсутній треонін у положенні ВЗО), однієї з найбільше важковидаляємих домішок інсуліну.

Для збільшення об'єму інсуліну, що випускається, і зменшення собівартості кінцевого продукту на ВАТ «Національні біотехнології» було вирішено розробити й запустити у виробництво схему одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ методом спільного гідролізу.

Даний метод заснований на одержанні первинного інсуліну в одну стадію шляхом одночасного впливу трипсину й карбоксипептидази В на ГБ. При більш високій технологічності основна проблема спільного гідролізу полягає в пошуку оптимальних умов, при яких утвориться мінімальна кількість дезтреонінінсуліну. Визначення кількості цієї домішки в гідролізаті є важким (за одними даним він невіддільний від інсуліну , а за іншимі - від дезамідоінсуліну). Однак завдяки великій економії часу й реактивів метод спільного гідролізу в цей час є найпоширенішим і використовується для виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ як у Росії (ИБХ РАН), так і за рубежем (Eli Lilly, США, Biobras, Бразилія).

Метою даної роботи був пошук оптимальних фізико-хімічних умов для проведення спільного (одностадійного)гідролізу ГБ.

УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.

У ході експериментів використовували карбоксипептидазу В с активністю 200 од/мг і трипсин з активністю 239 од/мг виробництва ГосНИИгенетика (Росія).

Основним методом визначення кількості й чистоти білків, що утворяться в ході гідролізу, була аналітична ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ, проведена на аналітичному ВЄЖХ-хроматографі «Dionex», США (колонка «Phenomenex», США, 250x4,6 мм, С18, розмір часток 5 мкм). Представлені хроматограми отримані при використанні програмного забезпечення «Chromeleon 6.0».

Продуцентом ГБ був штам Е. coli JM109/pPlNS07, отриманий спільно співробітниками ВАТ «Національні біотехнології» і ІБХ. Ренатурований ГБ надходив на стадію гідролізу в 0,1 М трис-HCl у концентрації 8 ± 2 г/л.

РЕЗУЛЬТАТИ.

Як відомо, спільний гідроліз ГБ протікає у дві стадії: трипсиноліз ГБ до проміжних продуктів (ДАІ й МОНОАРГІНІНІНСУЛІН) і їх карбоксипептидоліз із утворенням інсуліну. Таким чином, трипсиноліз є визначальною, а карбоксипептидоліз - залежною стадією спільного гідролізу. Отже, всі продукти трипсинолізу ГБ будуть продовжувати утворюватися й під час реакції спільного гідролізу.

Серед продуктів трипсинолізу ГБ крім ДАІ й МОНОАРГІНІНІНСУЛІНу у великій кількості містились домішки білоку (до 25% від загального білка), що має час виходу при ВЕРХ-аналізах трохи більше, ніж час виходу інсуліну. Завдяки цій його особливості білок був названий «правим плечем» (ПП) (мал. 2).

Мал. 2. Порівняння ВЕРХ-хроматограм гідролізу в присутності (суцільна лінія) і під час відсутності (пунктир) внутрішнього стандарту інсуліну: I — пік внутрішнього стандарту інсуліну; II — праве плече; III — пік діаргінінінсуліну: IV — пік моноаргінінінсуліну.

Даний білок утворювався й при проведенні спільного гідролізу (мал. 3).

Мал. 3. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного (трипсин + карбоксипептидаза) гідролізу ГБ: I - інсулін; II – ПП

Спроби очистити інсулін від даної домішки за допомогою іонообмінної і ВЕРХ-хроматографії призвели до великих втрат через те, що відділення ПП від інсуліну було важко виконати. Таким чином, головним завданням став пошук таких фізико-хімічних умов спільного гідролізу, при яких формується мінімальна кількість ПП.

Підбор оптимальних рН і температури проведення спільного гідролізу ГБ

Була виявлена строга залежність збільшення кількості ПП від підвищення температури (мал. 4).

Мал. 4. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного гідролізу ГБ залежно від температури: I — інсулін; II — ПП; 1 — гідроліз при 13°; 2 — гідроліз при 24°; 3 — гідроліз при 30°

Схожа картина була отримана при визначенні впливу рН на синтез ПП: кількість ПП збільшувалося при збільшенні рН.

Отримані залежності нелінійні й при проведенні експериментів при низьких температурах (1—6°) і значенні рН у районі 7,1 ± 0,1 було з'ясовано, що результати гідролізу практично не змінюються, однак зміст ПП усе ще великий (до 2—5%).

Експериментальним шляхом були знайдені оптимальні умови спільного гідролізу: рН = = 7,1 ±0,1 nt = 6± 1°.

Визначення оптимальної концентрації ферментів для одностадійного гідролізу ГБ

У результаті проведених експериментів було з'ясовано, що співвідношення ГБ : фермент впливає тільки на час гідролізу, але не на якість одержуваного продукту. Таким чином, головним при пошуку оптимальних концентрацій ферментів було визначення оптимального співвідношення трипсин : карбоксипептидаза В.

При проведенні трипсинолізу було помічено, що якщо вчасно не зупинити реакцію, то концентрація ДАІ починає зменшуватися, а ПП - збільшуватися. У результаті було зроблено припущення про те, що ПП - продукт побічного впливу трипсину на ДАІ. Зменшення такого впливу при проведенні спільного гідролізу можливо тільки при збільшенні кількості карбоксипептидази В, що трансформує ДАІ в інсулін.

У результаті проведених експериментів висунуте припущення було підтверджено й показанО, що при співвідношенні (по масі) карбоксипептидаза В : трипсин > 1,6:1 ПП у гидролизаті практично відсутній (мал. 5).

Мал. 5. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного гідролізу ГБ при рН 7,0,14° і співвідношенні карбоксипептидаза В:трипсин = 2:1

Отриманий у результаті гідролізу первинний інсулін містив незначну кількість ПП, що легко видалялася при іонообменій хроматографії (наприклад, з використанням носіїв на основі сефарози).

У результаті проведеної експериментальної роботи були визначені оптимальні фізико-хімічні умови проведення спільного гідролізу ГБ: температура реакційного середовища < 6°; рН = 7,1 ±0,1; співвідношення карбоксипептидаза В : трипсин > 1,6:1.

При проведенні подальших досліджень білок ПП був виділений у чистому виді й ідентифікований методом мас-спектрометрії як дезтреонінінсулін.

На основі отриманих даних виробництво ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУЛЮДИНИ на ВАТ «Національні біотехнології» перейшло на більш технологічну схему одержання первинного інсуліну з ГБ методом спільного гідролізу. Ця схема містить у собі два етапи: гідроліз і хроматографічне очищення інсуліну на SP-Sepharose FF.

Оптимальні умови проведення спільного гідролізу ГБ у промислових умовах наступні: рН = 7,1 ±0,l,t = 5± 1° і співвідношення (по масі) ГБ: карбоксипептидаза В : трипсин = 2000:1,6:1. Тривалість процесу гідролізу становить 15 ± 1 ч.

Нова технологічна схема процесу дозволила знизити собівартість первинного інсуліну в 2,5 рази й збільшити потужність виробничої лінії з 10 до 30 кг субстанції ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ в рік.

Використана література:

Теоретический и научно-практический журнал «Биотехнология» Москва, 2006.

№ 4, С56-63.