«использование ит в исследованиях биофизических свойств клеток крови» (стр. 3 из 5)
При этом условия обработки циклодекстринами были подобраны таким образом, чтобы жизнеспособность клеток не нарушалась.
Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в супернатантах определяли для оценки жизнеспособности нейтрофилов после инкубирования в присутствии МβCD или βCD с использованием набора реагентов фирмы “Анализ Х” (Минск, Беларусь).
Кинетический метод определения каталитической активности ЛДГ основан на ферментативной реакции:
Восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида HAДH имеет выраженный максимум поглощения в ультрафиолетовой области на 340 нм, тогда как окисленная форма HAД+ этого максимума не имеет. Различия в поглощении НАД+ и НАДН между 300 и 400 нм обусловлены изменениями никотинамидного кольца при окислении или восстановлении.
Такие различия в спектрах поглощения позволяют следить за ходом ферментативной реакции, например, по уменьшению величины оптической плотности А на длине волны 340 нм, т.е. по уменьшению содержания HAДH в анализируемом образце.
В таблице 2.1 представлена активность ЛДГ в супернатанте необработанных клеток (контроль) и клеток, обработанных в bCD 15 мМ в течение 15 и 30 мин, относительно активности ЛДГ в супернатанте клеток, обработанных 0,1% Тритоном Х-100.
Таблица 2.1 – Выход ЛДГ из нейтрофилов после воздействия bCD 15мМ
| Активность ЛДГ (% от общей активности фермента) | ||
| Время обработки bCD | 15 мин | 30 мин |
| Контроль | 12,9 ± 7,9 | |
| bCD 15мМ | 12,4 ± 1,8 | 10,4 ± 0,9 |
Таким образом, можно видеть, что воздействие на клетки bCD в течение 15 и 30 мин не оказывает значительного влияния на жизнеспособность клеток.
2.4 Измерение генерации H2O2 нейтрофилами
Продукцию Н2О2 нейтрофилами оценивали флуоресцентным методом на компьютеризированном спектрофлуориметре LSF1211А (“СОЛАР”, Минск, Беларусь) с использованием скополетина в качестве субстрата пероксидазной реакции [3]. Лектины добавляли к 1,5 мл суспензии нейтрофилов (106 кл/мл в фосфатно-солевом буфере, 37°С), содержащей 1 мкМ скополетина, 20 мкг/мл пероксидазы хрена и 1 мМ NaN3. Кинетику окисления скополетина регистрировали по уменьшению интенсивности флуоресценции при 460 нм (возбуждение при 350 нм). Для характеристики процесса лектин-индуцированной генерации Н2О2 нейтрофилами использовали два параметра: скорость продукции Н2О2 и длительность лаг-периода этого процесса, которая зависит от скорости сборки функционально активного НАДФН-оксидазного комплекса в плазматической мембране. Скорость продукции Н2О2 клетками определяли как тангенс угла наклона линейного участка кинетической кривой, на котором происходит падение интенсивности флуоресценции скополетина в результате его окисления Н2О2 . Лаг-период генерации H2O2 принимали равным промежутку времени между моментом добавления лектина к суспензии клеток и началом уменьшения интенсивности флуоресценции на кинетической кривой (началом линейного участка).
2.5 Исследование агрегации нейтрофилов
Агрегацию нейтрофилов изучали путем записи кинетических кривых изменения светопропускания клеточных суспензий при 540 нм с применением компьютеризированного агрегометра АР2110 (“СОЛАР”, Минск, Беларусь). Степень агрегации определяли как максимальное значение светопропускания клеточных суспензий на агрегационной кривой после инициирования процесса агрегации [3].
Стабильность WGA-индуцированных агрегатов нейтрофилов определяли по образованию межклеточных контактов, устойчивых к действию гаптенного углевода GlcNAc [3]. Как показано на рисунке 2.2, через 4-5 мин после добавления лектина (WGA) величина светопропускания клеточной суспензии достигала максимального значения и агрегационная кривая выходила на стационарный уровень. После достижения такого динамического равновесия в суспензию клеток для индукции дезагрегационного ответа добавляли GlcNАc и в течение 5 мин продолжали непрерывную запись кинетической кривой изменения светопропускания клеточных суспензий.
Рисунок 2.2 – Кинетические кривые WGA-индуцированной агрегации нейтрофилов и их дезагрегации при действии GlcNAc (22 мг/мл) в отсутствие (1) и присутствие (2) МβCD. I и I0 – параметры, используемые для расчета R. Нейтрофилы человека инкубировали в течение 10 мин при 37°С в присутствии MβCD (10 мМ) до внесения WGA (7,5 мкг/мл)
Для количественной характеристики стабильности агрегатов был введен параметр стабильности R, который рассчитывали по формуле:
,где R – параметр стабильности;
I − значение светопропускания клеточной суспензии через 5 мин после добавления гаптенного углевода;
I0 − максимальное изменение величины светопропускания суспензии клеток в процессе агрегации.
Параметр стабильности может иметь следующие предельные значения: R = 0% – все клеточные агрегаты разрушаются под действием гаптенного углевода и R = 100% – все клеточные агрегаты полностью устойчивы и нечувствительны к действию гаптенного углевода.
Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Изучение особенностей лектин-индуцированной продукции Н2О2 нейтрофилами с пониженным содержанием холестерина
Для исследования особенностей лектин-индуцированной продукции Н2О2 нейтрофилами с пониженным содержанием холестерина регистрировали кинетики тушения флуоресценции скополетина, возникающие при взаимодействии молекулы скополетина с молекулой пероксида водорода, продуцируемого нейтрофилами.
Для характеристики процесса лектин-индуцированной генерации Н2О2 нейтрофилами использовали два параметра:
1. скорость продукции Н2О2 – численно равна модулю тангенса максимального угла наклона линейного участка кинетической кривой;
2. длительность лаг-периода продукции Н2О2 (зависит от скорости сборки функционально активного НАДФН-оксидазного комплекса в плазматической мембране) – определяется длинной линейного горизонтального участка кинетической кривой от момента добавления в пробу лектина до момента начала спада (тушения флуоресценции).
Следует отметить, что программа регистрации данных на использованном спектрофлуориметре позволяет выводить данные в формате ASCII, однако не обладает возможностью для их первоначальной обработки. В таком виде полученные экспериментальными данными могут быть импортированы в программу Origin (см. рисунок 3.1) для графической визуализации и последующего сохранения проекта в виде рисунка, который может быть вставлен потом в текстовый документ.
Рисунок 3.1 – Графическая визуализация кинетик тушения скополетина в программе Origin
В программе Origin выполняется нормировка полученной кинетики на максимальное экспериментальное значение, чтобы выразить интенсивность сигнала в относительных величинах. Кроме того, оптимальным образом подбираются стили графической визуализации данных (стили, толщины, цвета линий и шрифтов). Для лучшего восприятия графической информации кинетические кривые тушения флуоресценции скополетина в пробах с различным типов нейтрофилов – обработанные и необработанные MβCD – представляются в одном проекте (на одном рисунке) с использованием нескольких слоев. Это позволяет проследить изменение выбранных характеристических параметров процессов, происходящих в системе при модификации свойств плазматической мембраны нейтрофилов.
Стоит отметить, что для получения достоверных результатов в биофизических исследованиях необходимо проведение серии экспериментов и дальнейшая статистическая обработка результатов. Анализ экспериментальных кривых – аппроксимацию линейного участка и последующую статистическую обработку результатов – также удобно производить при помощи средств Origin (рисунок 3.2).
Рисунок 3.2 – Графическая визуализация кинетик тушения скополетина в программе Origin (аппроксимация линейного участка кинетической кривой)
В ходе экспериментов было обнаружено, что базальный уровень флуоресценции скополетина, находящегося в клеточной среде в отсутствие и в присутствие MbCD, практически не изменялся (рисунок 3.3, кривая 1). При добавлении лектина ConA к суспензии клеток после небольшого промежутка времени (лаг-периода) наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции скополетина (рисунок 3.3, кривая 2), свидетельствующее об активации НАДФН-оксидазы и продукции Н2О2 лектин-активированными нейтрофилами.
В присутствии MbCD наблюдалось увеличение лаг-периода активации НАДФН-оксидазы ConA-активированных нейтрофилов с последующим более быстрым снижением интенсивности флуоресценции скополетина, свидетельствующим об увеличении продукции Н2О2 (рисунок 3.3, кривая 3).
Рисунок 3.3 – Кинетические кривые интенсивности флуоресценции скополетина в суспензии контрольных (1) и ConA-активированных нейтрофилов в отсутствие (2) и в присутствии MβCD (3). Нейтрофилы инкубировали в течение 10 мин при 37°С в присутствии MβCD (10 мМ) до внесения Con A (20 мкг/мл)
При действии почти всех использованных лектинов лаг-период активации НАДФН-оксидазного комплекса обработанных клеток увеличивался по сравнению с аналогичным параметром для необработанных клеток.