M. terrae требовательны к питательным средам, растут на элективных средах (реакция среды почти нейтральная (рН 6,4-7,0): Левенштейна-Йенсена, «Новая», Миддлбрука 7Н9 с 10% ростовой добавки ADC, 7Н10 с 10% ростовой добавки ОADC и др. Колонии M. terrae на среде Левенштейна-Йенсена - шероховатые и матовые выпуклые округлые образования, на среде «Новая» - гладкие и блестящие или с молочным или желтоватым оттенком. Длительность роста M. terrae на питательных средах зависит от состава среды. При оптимальной температуре икубирования на «богатых» питательных средах Левенштейна-Йенсена и «Новая» рост M. terrae может появиться на 5-7 сутки. На «голодных» питательных средах инкубация M. terrae составляет до 8 недель.
M. terrae гидролизуют Твин 80 (т.к. продуцируют липазы), имеют высокоактивную каталазу и проявляют β-галактазную активность. Восстанавливают теллурит калия до металлического теллура в течение 9 дней.
По классификации патогенных для человека микроорганизмов относится к IV группе опасности, является непатогенным микроорганизмом.
Mycobacterium terrae используют для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций.
Тест-микроорганизм M. terrae хранится в Американской коллекции типичных культур (American Type Culture Collections); Немецком музее микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ - Deutcshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) и в других организациях.
Приложение 2.
Методики приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций
Методика приготовления среды Петраньяни
В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:
1) Пептон – 2г
Крахмал- 12 г
Молоко – 300 мл
Яйца – 10 шт.
Картофель – 2 шт.
Малахитовый зеленый — 2 г
Глицерин- 24 мл
Вода -100мл
2). В стерильную колбу (1л) помещают 12 г крахмала и 2 г пептона. Затем добавляют 2 шт. мелко нарезанного картофеля (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят). Доливают в колбу 300 мл свежего цельного молока и подогревают на водяной бане в течение часа (с момента начала свертывания молока) при постоянном помешивании. В другую стерильную колбу разбивают 8 диетических яиц и 2 желтка. Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 минут в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Яйца тщательно взбивают до однородной массы и переливают в колбу со смесью крахмала, пептона, картофеля и молока. Сюда же добавляют 24 мл глицерина и 16 мл 2% раствора малахитовой зелени. Полученную смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлевый фильтр в стерильную колбу. Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа “АСПС”. Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8 – 10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 850С в течение 45 минут.
3). Приготовление раствора малахитового зеленого:
Малахитовый зеленый — 2 г
Стерильная дистиллированная вода — 100 мл
Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 часа для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.
Методика приготовления картофельно-глицеринового бульона
Готовят картофельный отвар. На 1 л питьевой воды берут 200г очищенного (картофель предварительно моют с мылом и щеткой, чистят) картофеля, отваривают в течение 30 мин с момента закипания, остужают и отстаивают. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят водой до первоначального объема, добавляют 10 мл глицерина. рН картофельного бульона 7,0-7,2. Бульон стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут.
Методика приготовления картофельно-глицеринового агара
В рецептуру питательной среды входят следующие компоненты:
Картофельно-глицериновый бульон
Пептон-5г
Мел- 1г
Агар-агар -20г
Вода – 1 л
К картофельно-глицериновому бульону добавляют 5г пептона, 20г агар-агара, 1 г мела, устанавливают рН 7,0-7,2. Агар расплавляют и разливают в пробирки или колбы. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут.
Методика приготовления среды Миддлбрука 7 H 9 (бульон) с 10 % ADC ростовой добавкой (MADC-бульон для хранения замороженных культур при минус 70ºС)
Миддлбрук 7H9 порошок бульона 4,7 г
Глицерин (С3Н8О3) 100,0 мл
Вода (стерильная, дистиллированная) 750,0 мл
Ингредиенты соединить, перемешать, стерилизовать в паровом стерилизаторе при 1,1 атм. (121°С) в течение 10 минут, охладить до 45ºC. Добавить в асептических условиях 100 мл ростовой добавки ADC и стерильной дистиллированной воды до 1000,0 мл.
pH среды будет эквивалентен 6,6 ± 0,2 в бульоне, остывшем до 25ºC.
Методика приготовления среды Левенштейна-Йенсена
Среда Левенштейна-Йенсена – международная среда, широко используемая в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности.
Это плотная яичная среда, на которой видимый рост M. terrae получают приблизительно на 14-21-й день после посева.
Для чистоты эксперимента желательно использовать готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками.
При невозможности приобретения готовой среды, ее можно приготовить самостоятельно.
В состав среды Левенштейна-Йенсена входят следующие компоненты:
Раствор минеральных солей:
Калий однозамещенный фосфорнокислый 2,4 г
Магний лимоннокислый 0,6 г
Магний сернокислый 0,24 г
L- аспарагин 3,6 г
Глицерин 12,0 мл
Вода дистиллированная 600 мл
Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. L-аспарагин рекомендуется растворять отдельно и вносить последним. Затем солевой раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 20 - 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.
Раствор малахитового зеленого:
Малахитовый зеленый — 2 г
Стерильная дистиллированная вода — 100 мл
Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1-2-2,5 часа для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. (1210С) в течение 30 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.
Яичная масса
Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 минут в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Перед тем, как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20–25 яиц, в зависимости от их величины). Тщательно взбивают яичную массу стерильным венчиком или в стерильном миксере при минимальной скорости.
Приготовление среды.
В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают следующие растворы:
Раствор минеральных солей — 600 мл
Гомогенизированная яичная масса — 1000 мл
Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через 4-х слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 минут разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.
Коагуляция (свертывание) среды.
Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа “АСПС”. Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8 – 10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 850С в течение 45 минут.
Хранение среды.
Готовую питательную среду проверяют на стерильность, помещая 10 пробирок из вновь приготовленной партии в термостат при 370С на 3 суток. По истечении времени инкубации в пробирках на питательной среде должен отсутствовать микробный рост. В случае наличия роста приготовленная партия среды подлежит уничтожению. Приготовленная партия среды должна иметь этикетку с датой изготовления и сохраняться в холодильнике при 40С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.
Методика приготовления среды «Новая»
Среда «Новая» - это плотная яичная среда, на которой хороший рост колоний M. terrae получают приблизительно на 5-7-й день после посева материала (проб).
В рецептуру питательной среды «Новая» входят следующие компоненты
(в весовых %):
| Калий фосфорнокислый одноосновной | 0,05 |
| Натрий лимоннокислый | 0,05 |
| Магний сернокислый | 0,05 |
| Натрий пировинограднокислый (гликокол) | 0,2 |
| Глицерин | 3,6 |
| Малахитовая зелень | 0,036 |
| Желтки яиц | 50,0 |
| Дистиллированная вода | до 100,0 |
Способ получения концентрированной питательной среды заключается в смешивании сухих навесок ингредиентов солей (кроме бактерицидного красителя) с желточной массой, обработки ингредиентов 70º этиловым спиртом, растворении бактерицидного красителя в глицерине и соединении всех компонентов среды.