«Санкт-Петербургский нии эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» (стр. 11 из 12)
В таблице 1 приведены основные биохимические тесты, позволяющие дифференцировать иерсиний от других микроорганизмов, имеющих с ними сходство, а также определить их видовую принадлежность и биотип Y. enterocolitica.
Серологическая идентификация
Серотипированию подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к виду Y. enterocolitica и/или Y. pseudotuberculosis. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к Y._ enterocolitica серогрупп; О:3; О:4; О:4,32; О:4,33; О:5; О:5,27; О:6,30; О:6,31; О:7,8; О:9; О:13; О:13,7 и другие; к Y._pseudotuberculosis серотипов I и III.
Идентификация вирулентных иерсиний
Среди методов обнаружения вирулентных иерсиний для рутинной практики, наиболее адекватными являются:
1. Фенотипические методы, основанные на выявлении признаков вирулентности, связанных с функционированием плазмиды pYV 42-48 МДа, прежде всего аутоагглютинации и кальцийзависимости роста иерсиний.
Определение способности к аутоагглютинации
Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жидкой среде и состоит в спонтанном склеивании клеток иерсиний.
Для посева используют чистые культуры иерсиний. Засевают 106-108 кл/мл в 2 пробирки со средой Кларка, одну из которых инкубируют при температуре (37±1) оС, другую - при (26±2) оС в течение 24-48 ч.
При положительном результате pYV+ иерсинии образуют рыхлый хлопьевидный осадок в первой пробирке (при (37±1) оС); во второй пробирке – равномерное помутнение, осадок чаще не большой, компактный. При отрицательном результате рост pYV- иерсиний создает в обеих пробирках равномерное помутнение среды, хлопья отсутствуют.
Определение кальцийзависимости роста иерсиний
Данное свойство проявляется в ограничении роста бактерий (бактериостаз), наступающем при дефиците ионов Са2+. Определение проводят на модифицированной среде АГВ (кальцийдефицитный агар) при температуре (37±1) оС. Исследуемые культуры инкубируют на бульоне Хоттингера при (26±2) оС в течение 24 ч, затем засевают на две чашки с кальцийдефицитным агаром, одну из которых инкубируют при температуре (37±1) оС, другую - при (26±2) оС в течение 48 ч.
При положительном результате pYV+ колонии, выросшие при температуре (37±1)_оС, значительно мельче (до 1 мм), чем при (26±2) оС, или отсутствуют (чаще у возбудителя псевдотуберкулеза). При отрицательном результате размеры pYV- колоний как при (37±1) оС, так и при (26±2) оС такие же, как на обычных средах.
При идентификации вирулентных иерсиний в качестве контрольных рекомендуется использовать референтные плазмидосодержащие штаммы Y. enterocolitica серотипов О:3; О:9 (№188 в коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича и № КМ-33 (201) в коллекции РосНИПЧИ «Микроб»).
2. Специфический агглютинационный тест, основанный на использовании антител к антигенам вирулентности иерсиний (БНМ), детерминируемым плазмидными генами.
Реакция агглютинации (РА) на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям (СВИ) является экспресс-методом, позволяющим дифференцировать вирулентные pYV+ штаммы представителей рода Yersinia от авирулентных. Для постановки РА используют свежевыделенные культуры. Исследуемую культуру выращивают на чашке Петри или в пробирке со скошенным агаром Хоттингера при (37±1) оС в течение 18-24 ч и столько же при (26±2) оС. Далее постановка и учет реакции осуществляется по общепринятой методике (изложена в инструкции по применению).
4.4. Иммунологические методы выявления
специфических антигенов
Методы, направленные на выявление специфических антигенов, являются наиболее перспективными для ранней диагностики инфекций, обусловленных иерсиниями. Основное их преимущество – быстрота получения результатов при высокой чувствительности.
В настоящее время для выявления антигенов иерсиний в различных субстратах используются:
- «Диагностикумы коагглютинирующие псевдотуберкулезные и иерсиниозные» для реакции коагглютинации (РКоА), предназначенные для выявления микробных антигенов, а при подращивании - живых возбудителей в материале от больных (испражнения, моча, слюна) на первой неделе болезни, а также антигенов, связанных в составе иммунных комплексов.
- Диагностикум латексный для выявления Yersinia pseudotuberculosis «Псевлат» для реакции агглютинации латекса (РАЛ). Реакцию используют для выявления антигенов возбудителя псевдотуберкулеза в копрофильтратах больных и в смывах с объектов внешней среды.
- «Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза I серотипа».
Материал для исследования, сроки и правила его взятия представлены в таблице 4 (аналогично подготовке материала для бактериологического метода).
Исследования проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3-5 сутки после подращивания при 4 оС в ПК среде. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин при (56±1) оС, центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
4.5. Молекулярно-генетические методы
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет выявить генетические детерминанты, локализованные на плазмиде вирулентности pYV или хромосоме, кодирующие ряд факторов патогенности.
Основная трудность ПЦР заключается в том, что при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды реакция может ингибироваться биологическими продуктами деградации тканей, ферментами, полисахаридами и другими компонентами исследуемого материала. Поэтому перед постановкой реакции необходимо подготовить пробы к исследованию, (т.е. выделить тотальную ДНК).
Подготовка проб
Кровь. 50 мкл нативной крови смешивают со 100 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-НСl, рН 8,0, 0,5 % Твин-20, 100 мкг/мл протеиназы К) и инкубируют 1 ч при 56 0С, затем протеиназу К инактивируют 10 мин при 95 0С, смесь центрифугируют 3 мин при 5000 об/мин. Для анализа в ПЦР достаточно 2-3 мкл надосадочной жидкости.
Моча. 10-20 мл мочи центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. К осадку добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды и прогревают при 100 0С 10 мин. Центрифугируют при 5000 об/мин. Для исследования в ПЦР берут 1-3 мкл надосадочной жидкости (38).
Вода. 1,0-2,0 л воды фильтруют через 0,22 мкм бумажный фильтр. Затем фильтр измельчают и погружают в 300 мкл метанола на 15 мин. После высушивания под вакуумом к измельченному образцу добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды, прогревают при 100 0С 5 мин, центрифугируют при 5000 об/мин 5 мин. Для исследования в ПЦР берут 1-3 мкл надосадочной жидкости.
Испражнения, помет грызунов, тонкий кишечник грызунов, смывы с объектов окружающей среды, почва. Подготовка материала основана на использовании щелочной обработки, при котором большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают, что обеспечивает снижение концентрации ингибиторов в пробе:
1. исследуемый материал суспендируют в ФБР в соотношении 1:10 и центрифугируют при 500-1000 об/мин 1,5-2 мин для осаждения грубых частиц или отстаивают 2-3 ч при комнатной температуре;
2. 0,2-0,5 мл верхней фазы переносят в лунку полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с таким же объемом 0,72 % КОН;
3. после 25-30 с экспозиции проводят посев материала на СБТС и сразу же в лунки планшета добавляют 0,2-0,5 мл бульона Хоттингера для прекращения действия щелочи, как селективного агента;
4. материал из лунки переносят в пробирку типа «Эппендорф» и центрифугируют на микроцентрифуге при 10000-12000 об/мин 3-5 мин;
5. надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды центрифугированием промывают дистиллированной водой;
6. к осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин при 100 0С, центрифугируют при 12000 об/мин 2 мин. Для ПЦР используют 1-3 мкл надосадочной жидкости.
Пищевые продукты гомогенизируют в ЗФР в соотношении 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин, центрифугируют при 12000 об/мин 10 мин, осадок суспендируют в 300-500 мкл дистиллированной воды и проводят дальнейшую обработку в соответствии с п. 2.
Постановку ПЦР осуществляют согласно наставления к наборам для ПЦР «Амплисенс®Yersinia pseudotuberculosis» и «Амплисенс®Yersinia enterocolitica»
Для учета результатов ПЦР проводят электрофорез в 1,5 % агарозном геле. После окрашивания этидий бромидом гель просматривают в трансиллюминаторе с длиной волны ультрафиолетового излучения 310 нм. Образовавшиеся в результате реакции амплифицированные фрагменты ДНК (полосы в геле, светящиесяся в УФ-лучах) идентифицируют по размеру, сравнивая с маркером молекулярного веса или положительным контролем.
Использование ПЦР дает возможность получить сигнальный результат в течение 1-х суток исследования, а наиболее короткий срок выделения культуры и идентификации иерсиний составляет 5-8 суток.
ПЦР-анализ можно использовать при 3-х этапном варианте бактериологического исследования.
| 1 этап: Подготовка проб: 1 г материала + 9 мл ЗФР (1:10). Суспендировать, грубые частицы осадить в центрифуге при 1000 об/мин–30 с. |  100 мкл | подготовка проб для ПЦР | | Проведение ПЦР, электрофорез, получение результата через 4 – 6 часов после поступления материала |
