Кровь и спинномозговую жидкость отбирают, соблюдая правила асептики, в острый период болезни и переносят в пластиковую пробирку с плотно закрывающейся (завинчивающейся) пробкой. На пробирку наклеивают этикетку с указанием фамилии, имени, отчества больного, вида материала, даты отбора (Прилож. 7).
Отбор проб секционного материала проводит патологоанатом или судмедэксперт.
Пробы внутренних органов (печень, легкие, селезенка, почки, головной и спинной мозг) отбирают из нескольких участков, как подвергшихся изменениям, так и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание обращают на пограничную зону. Пробы различных органов отбирают в объеме не менее 2 - 3 куб. см. Отбор секционного материала необходимо проводить как можно быстрее после смерти больного (не позднее 20 ч при комнатной температуре).
Добавление консервантов и инактивация материала для вирусологического исследования недопустима.
Секционный материал следует отбирать таким образом, чтобы избежать бактериального загрязнения исследуемых тканей. Отобранный материал помещают в стерильные пробирки с плотно закрывающимися (завинчивающимися) пробками, снабжают направлением (Прилож. 5), завязывают и опускают в емкость для транспортирования, оставляя снаружи концы завязок с этикеткой.
Взятие, обработку и доставку материала для вирусологических исследований от больных людей проводят в соответствии с требованиями, изложенными в Прилож. 2.
9.1.2. Отбор проб для серологического исследования
Целью серологического исследования является выявление специфических антител IgM и IgG, а также антигена ВЗН в сыворотке крови, спинномозговой жидкости больного и секционном материале.
Объекты серологического исследования:
- сыворотка крови;
- спинномозговая жидкость;
- секционный материал.
Для серологического исследования необходимо двукратное взятие крови. Первую пробу берут при поступлении больного с подозрением на ЛЗН, вторую - через 10 - 14 дней после первого забора крови (Прилож. 8).
Кровь у больного отбирают из локтевой вены в стерильную пробирку в количестве 8 - 10 мл, соблюдая правила асептики. Для предотвращения гемолиза сыворотку следует отделить от сгустка. Сгусток сохраняется в пробирке только при первом заборе и используется для вирусологического и молекулярно-генетического исследований.
9.1.3. Отбор проб для молекулярно-генетического исследования
Целью молекулярно-генетического исследования является выявление специфической РНК вируса в крови больных и в секционном материале.
Объекты молекулярно-генетического исследования:
- плазма крови;
- спинномозговая жидкость;
- моча;
- секционный материал.
Плазму крови исследуют в 1 - 10 дни болезни, лейкоцитарную фракцию крови исследуют в 1 - 20 дни болезни, мочу исследуют с 5 по 20 дни болезни.
Подготовку проб для исследования методом ПЦР проводят согласно инструкции производителей тест-систем.
Взятие цельной периферической крови проводится утром натощак только с применением одноразового медицинского инструментария в одноразовые пробирки с 6% раствором ЭДТА из расчета 1:20. В течение 8 ч (не позже) с момента забора крови следует отобрать плазму и перенести ее в новую пробирку.
Для исследования лейкоцитарной фракции крови (при исследовании данного вида клинического материала возрастает чувствительность теста) 1,5 мл крови с раствором ЭДТА переносят в пробирку типа Эппендорф и центрифугируют на микроцентрифуге при 800 g (800 об./мин.) в течение 10 мин. Затем отбирают приблизительно 500 - 600 мкл плазмы и центрифугируют при 11000 g (11000 об./мин.) в течение 10 мин. После чего оставляют для выделения РНК осадок клеток и 100 мкл надосадочной плазмы над клетками.
Для исследования мочи 20 мл утренней порции мочи переносятся в пробирку объемом 20 мл с плотно завинчивающейся крышкой. В пробирку также вносится глицерин в расчете 100 мкл на каждый 1 мл мочи. Жидкость в пробирке аккуратно перемешивается для равномерного распределения глицерина и сразу замораживается при температуре не выше -18 °C.
Отбор проб спинномозговой жидкости и секционного материала осуществляется в одноразовые пробирки так же, как для вирусологического исследования.
Допускается хранение плазмы крови и СМЖ до проведения исследования в течение 3 - 4 суток при температуре от 2 до 8 °C или 1 неделю - при температуре -18 °C. Далее образцы должны храниться при температуре не выше -70 °C. Ткани мозга, осадки лейкоцитов крови и мочи сразу после взятия или пробоподготовки помещают на хранение при температуре -18 °C (не более недели), далее они хранятся при -70 °C. Следует избегать оттаивания-замораживания материала до проведения исследования.
9.2. Методы лабораторной диагностики людей, больных
или подозрительных на заболевание ЛЗН
Вирусологический метод: для выделения вируса используют биопробных животных - 1 - 2-дневных сосунков белых мышей и клеточные линии Vero-E6, PS, BMK-21 и другие.
9.2.1. Изоляция вируса ЛЗН с помощью биопробных животных
Материал вводят мышам-сосункам интрацеребрально по 0,01 мл с последующим наблюдением до 14 суток. Животных с характерными для ЛЗН симптомами заболевания (малоподвижность, анорексия, паралич) умертвляют, асептически извлекают мозг, из которого готовят 20% суспензию в буферном растворе при pH 7,2 - 8,0. Вируссодержащую суспензию используют для последующих пассажей с целью накопления антигенного материала и идентификации вируса в комплексе серологических и молекулярно-генетических методов.
9.2.2. Изоляция вируса ЛЗН на культуре клеток
Для изоляции вируса ЛЗН возможно использование клеток линий Vero-E6, PS, BMK-21 и других. Клетки со второго дня после заражения просматривают на наличие цитопатического эффекта (ЦПЭ). Регистрация ЦПЭ является основанием к использованию вируссодержащей культуральной жидкости для последующих пассажей с целью накопления антигенного материала и идентификации вируса в комплексе серологических и молекулярно-генетических методов.
9.2.3. Серологический метод
Выявление специфических антител класса M (IgM) и класса G (IgG) осуществляется с помощью иммуноферментных тест-систем в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями. Суммарные специфические антитела можно выявить с помощью РТГА и РСК. Выявление антигена вируса возможно в ТИФА, РСК и РАО.
Подготовка сывороток крови к серологическому исследованию: для предотвращения гемолиза сыворотку следует отделить от сгустка крови. Для этого пробирку с кровью помещают в термостат при 37 °C в скошенном положении, затем образовавшийся сгусток крови обводят стеклянной палочкой и помещают в вертикальном положении в холодильник при температуре 2 - 8 °C на 2 - 3 ч. Полученную сыворотку отбирают автоматическим дозатором со стерильным наконечником в пластиковую пробирку. Сгусток сохраняется в пробирке только при первом заборе и может быть использован для вирусологического исследования. Перед исследованием сыворотки крови инактивируют на водяной бане в течение 30 мин. при температуре 56 °C.
9.2.4. Молекулярно-биологический метод
Выявление РНК вируса ЗН методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводят либо с электрофоретическим учетом результата реакции в агарозном геле, либо в формате флуоресцентной детекции, в т.ч. и режиме реального времени.
РНК из проб выделяют с помощью наборов для выделения РНК в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией. Предпочтение следует отдавать методикам и наборам для выделения РНК, входящим в состав тест-систем. Работу проводят, используя одноразовую пластиковую посуду, в боксах 2 - 3 классов биологической безопасности. ОТ-ПЦР осуществляют с помощью сертифицированных тест-систем в соответствии с прилагаемыми инструкциями. С учетом возможности циркуляции на территории Российской Федерации штаммов ВЗН различных генетических групп, тест-системы должны быть способны детектировать любые из них.
9.3. Оценка результатов лабораторных исследований больных
или подозрительных на заболевание ЛЗН
9.3.1. Клинический диагноз ЛЗН считают подтвержденным при выделении инфекционного агента, идентифицированного как вирус ЛЗН; при выявлении ТИФА IgM в одной сыворотке в титре, равном или выше 1:800; при обнаружении в исследуемых образцах специфического фрагмента РНК вируса ЛЗН. При одновременном исследовании парных сывороток крови на наличие IgG к вирусу ЛЗН диагноз считают подтвержденным при 4-кратном увеличении титра. Отсутствие нарастания титра антител указывает на наличие анамнестических антител. Результаты лабораторных анализов оформляют в соответствии с Прилож. 9, 10.
9.3.2. При оценке результатов серологического исследования необходимо учитывать, что IgM в спинномозговой жидкости появляются на 3 - 5 сутки от начала клинических проявлений болезни, а в сыворотке крови - на 2 - 3 дня позже (при тяжелых формах течения болезни). При легком течении ЛЗН IgM в сыворотке крови определяют со 2 - 5-го дней болезни.
9.4. Изучение иммунной прослойки выборочных групп
населения, проживающих в природных очагах ЛЗН
Изучение иммунной прослойки является дополнительным критерием в оценке состояния природного очага ЛЗН.
Объектом для изучения иммунной прослойки являются сыворотки крови лиц из выборочных групп населения, проживающего постоянно на территории природного очага не менее 10 лет. Наличие специфических антител свидетельствует о перенесенном ранее заболевании.
9.5. Лабораторное исследование полевого материала
из природных очагов ЛЗН
Лабораторное исследование полевого материала проводится вирусологическим, серологическим и молекулярно-биологическим методами.
Верификация вируса ЛЗН осуществляется в Национальном центре ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в соответствии с Приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 N 88.