Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Микробиология молока и молочных продуктов» для специальности 2710«Технология молока и молочных продуктов (стр. 3 из 12)

Через такую тонкую пленку лучи проходят не задерживаясь, падают на объективную линзу.

При помощи электронного микроскопа можно получить изображение объекта, увеличенное в 40000-50000 раз. Последующее оптическое увеличение в 5-6 раз позволяет получить полезное увеличение до 200000-300000 раз. Разрешающая способность современных электронных микроскопов от 1,5 до 0,8 и даже 0,5 км;

Одним из недостатков электронной микроскопии является исследование микроорганизмов только в фиксированном состоянии, так как электроны, проходя через препарат, убивают живую клетку.

Подготовка предметных и покровных стекол

Препараты готовят на предметных стеклах и покрывают сверху покровным стеклом.

Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и тщательно обезжиренными. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые пузырьки. Стекла, бывшие в употреблении выдерживают 1-2 ч в хромовой смеси (1л воды, 50 г дихромата калия, 100 г технической серной кислоты),. После чего ополаскивают, теплой водой и спиртом, В повседневной работе для удаления жира предметные стекла натирают куском мыла, после чего вытирают чистой хлопчатобумажной салфеткой. Хранят чистые предметные стекла в сухом состоянии или в банках с притертыми пробками, заполненными 96%-ным спиртом. Вынимать стекла следует пинцетом. Перед употреблением стекла просушивают на воздухе и протирают чистой тканью. Покровные стекла также должны быть хорошо вымыты, высушены и храниться в специальных коробках или чашках Петри.

Вопросы для самопроверки

1 1 Чем производится пересев микроорганизмов из одной среды в другую?

2 Укажите методы и режим стерилизации стеклянной посуды.

3 Как производится стерилизация питательных сред в кипятильнике Коха?

4 Перечислите и укажите значение каждой части оптической системы микроскопа.

5 Как определить увеличение оптического микроскопа?

6 Какие части микроскопа входят в его механическую часть?

7 Как производится подготовка предметных и покровных стекол к работе?

Лабораторная работа № 2

Техника микроскопирования. Приготовление и

микроскопирование фиксированных окрашенных препаратов.

Изучение морфологических признаков бактерий

Оборудование и материалы. Бактерии-кокки, свежая культура сенной палочки, водный раствор метиленовой сини, предметные и покровные стекла, бактериологическая петля, горелка, промывалка, микроскоп, ванночка с мостиком (две параллельные стеклянные палочки, с единенные кусочком резинового шланга).

Порядок приготовления рабочего раствора. Прежде чем приготовить рабочие растворы красок, нужно заблаговременно из сухих красок приготовить насыщенный спиртовой раствор. Для этого краску заливают 96%-ным спиртом в соотношении 1:10. Рекомендуется брать на 100 мл спирта 7,0 г метиленовой сини, 4,8 г генцианвиолета, 8,1 г основного фуксина. Из насыщенных спиртовых растворов готовят водные рабочие растворы: к 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини добавляют 100 мл дистиллированной воды и 10 мл 1%-ного раствора едкого кали (или едкого натра). Раствор краски может долго сохраняться и по истечении некоторого времени красит лучше, чем свежеприготовленный.

Задание I. Изучите технику микроскопирования

Согласно правилам работы с биологическим микроскопом, приведенным выше, установите микроскоп перед источником света. С помощью "револьвера" закрепите объектив с увеличением 8х. Легкий упор и звук щелчка пружины "револьвера" свидетельствует о том, что объектив установлен по оптической оси макрометрическим винтом опустите объектив на расстояние 0,5-1 см от предметного столика. Полностью откройте ирисовую диафрагму и поднимите конденсор до упора. Смотря в окуляр и, поворачивая зеркало, направив лучи от источника света через отверстие ирисовой диафрагмы на объектив. Приготовленный заранее окрашенный препарат поместите на предметный столик и закрепите клеммами. С помощью сухого объектива 8х рассмотрите несколько полей зрения. Нужный для исследования участок установите в центре поля зрения. Поднимите тубус, вращением револьвера переведите объектив с увеличением 40х. Наблюдая сбоку, макроцентрическим винтом опустите тубус с объективом почти до соприкосновения с препаратом. Смотря в окуляр, очень медленно поднимайте тубус до появления контуров изображения. Точную фокусировку следует производить с помощью микрометрического винта, вращая его в ту или другую сторону, по не более, чем на один полный оборот. Рассмотрев препарат, поверните макрометрический винт, поднимите тубус, снимите со столика препарат. Рассмотрите 2-3 фиксированных препарата.

Задание 2. Приготовьте фиксированный окрашенный препарат бактерий

Преимущества препаратов фиксированных клеток. Фиксированными считаются клетки микроорганизмов, в которых прервали жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура. Окрашенные фиксированные клетки и части их строения резче выделяются на фоне препарата. Это облегчает изучение формы, размеров, внутреннего строения клетки. Фиксированные препараты обычно рассматривают с иммерсией. Приготовление препарата состоит из следующих операций:

Приготовление мазка, высушивание, фиксация и окраска мазка.

Порядок проведения работы. Готовить препарат нужно на совершенно чистых обезжиренных предметных стеклах. Предметные стекла берут пинцетом или пальцами за ребра и проносят через пламя горелки, слегка обжигая, после чего кладут обожженной поверхностью кверху на мостик. Бактериологической петлей, простерилизованной в пламени горелки и охлажденной, нанести каплю исследуемой взвеси микроорганизмов на предметное стекло и краем покровного (предметного) стекла прикоснуться под углом 30° к капле исследуемого материала (рис.8).

Рис.8.

1. Приготовление мазка.

1. Быстрым движением от себя равномерно тонким слоем распределить исследуемую пробу по всей поверхности стекла.

2. Высушивание.

2. Приготовленный мазок высушить при комнатной температуре.

3. Фиксация мазка.

Затем высушенный мазок фиксируется для того, чтобы: умертвить клетки микроорганизмов, плотно прикрепить их к стеклу, в результате чего они не смываются при последующих операциях; улучшить окрашивание, т.к. мертвые клетки становятся более проницаемыми для красителей. Препарат мазком вверх 3-5 раз пронести через наиболее горячую часть пламени горелки. Предметное стекло с мазком нагревают не более 2-3 секунд, пока не возникнет ощущение легкого жжения, если приложить его к кисти руки. Более длительная термическая фиксация может изменить структуру микробных клеток и их форму.

4. Окрашивание мазка.

На фиксированный препарат, помещенный на мостик, установленный над ванночкой, нанести 3-5 капель (в зависимости от величины мазка) раствора красителя. Через 3-5 минут препарат промывается водой из промывалки до тех пор, пока стекающая вода станет почти неокрашенной. При этом стекло следует держать наклонно. Затем окрашенный препарат высушивают на воздухе.

5. Микроскопировать окрашенный мазок следует с иммерсионным объективом 90х. Для этого на препарат наносят каплю иммерсионного масла, помещают на предметный столик микроскопа и зажимают клеммами. Поворачивая -револьвер, иммерсионный объектив устанавливают по центральной оптической оси. Конденсор, следует поднять вверх до упора, ирисовую диафрагму конденсора открыть полностью. Глядя сбоку, макрометрическим винтом опустить тубус до погружения объектива в масло, почти до соприкосновения линзы с предметным стеклом препарата. Смотря в окуляр и медленно вращая макрометрический винт на себя, не отрывая объектив от масла, приподнимите тубус до появления контуров объекта. Помните, что свободное рабочее расстояние в иммерсионном объективе равно 0,1-0,15 мм. Затем микрометрическим винтом произведите точную фокусировку. Рассмотрите препарат в нескольких полях зрения.

Рассмотренные препараты надо зарисовать. По окончании работы поднять тубус, снять препарат в осторожно протереть фронтальную линзу объектива сначала сухой мягкой хлопчатобумажной салфеткой, затем той же салфеткой, но слегка смоченной чистым бензином. Препарат освободить от масла сначала, кусочком фильтровальной бумаги, затем обработать стекло бензином.

Задание 3. Методы окраски бактерий по Граму.

1) На фиксированный мазок через полоску фильтрованной бумаги наносят краситель генциан-виалет на 2-3 минуты.

2) С мазка снимают фильтровальную бумагу и окрашиваю мазок раствором Люголя 1-2 минуты,

3) Сливают раствор Люголя с мазком и обрабатывают препорат 96% спиртом 30-60 секунд.

4) Промывают мазок водой и подсушивают фильтрованной бумагой. (ГР(+) Б в темно-фиолет; ГР(-) Б - бесцвет.)

5) Дополнительно окрашивают препарат фуксином 2-3 минуты, промывают подсушивают фильтровальной бумагой. (ГР. (+) Б окрашивают в темно-фиолет;

ГР(-) Б - розовый.)

Вопросы для самопроверки

1 Каков порядок просмотра препарата в биологическом микроскопе?

2 Как определить увеличение микроскопа?

3 Какое фокусное расстояние у линз при работе с объективом 8х и 40х?

4 Перечислите порядок приготовления фиксированного препарата.

Лабораторная работа №3

Изучение морфологических признаков дрожжей

(препарат "раздавленная капля")

Оборудование и материалы. Чистая культура дрожжей и прессованные хлебопекарные или пивные дрожжи, предметные и покровные стёкла, бактериальные петли и иглы, пипетка, фильтровальная бумага, ванночка с мостиком, промывалка, микроскоп.