Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск (стр. 9 из 13)
Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320.
4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы
по Баху»
Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO4. Реакция протекает по уравнению
1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода.
Материалы и реактивы: препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H2SO4; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH2PO4 в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH2PO4); 0,1 моль/л раствор KMnO4.
Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат.
Ход работы. В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H2SO4, затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H2SO4 и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO4 до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия.
Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:
,где
– разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO4, мл;Q – количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее
1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO4.
4.3 Лабораторная работа «Капельный метод
(по Климовскому и Родзевич)»
Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате α-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате α-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов.
За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 ºС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см3 раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см3 раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе.
Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер.
Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции.
Материалы и реактивы: ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов – 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см3 дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см3 с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см3 основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см3. Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления.
Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат.
Ход работы. Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С.
Субстрат в количестве 25 см3 (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см3 (15 мл) вытяжки и 30 см3 (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 ºС в течение
10 минут.
Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см3 исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см3. Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см3, а воду вообще не добавлять.
Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси.
Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до
20 минут.
Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.
Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см3 не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см3 раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см3, внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25).
Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:
где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 см3 1 %-ного раствора, г;
60 – коэффициент пересчета на 1 ч;
n – количество фермента, участвующего в реакции, г или см3 (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения);
t – время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин.
Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см3 забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см3 доведено в мерной колбе до 50 см3 дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см3, т.е. получена такая последовательность разведения:
5 г → 100 см3 → 20 см3 → 50 см3 → 2 см3.
Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см3 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см3) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:
При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:
,где W – влажность культуры или препарата.