Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск (стр. 10 из 13)
Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.
Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 ºС.
За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта.
Материалы и реактивы: 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат – 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения.
Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется.
Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см3 буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см3, к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см3 буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане.
Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат.
Ход работы. К 10 см3 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см3 реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см3, куда предварительно наливают 20 см3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски.
Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 3 ч 1 см3 реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см3, куда предварительно наливают 20 см3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта.
Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:
,где А – количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл;
t – продолжительность протеолиза, ч;
Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см3 жидкого ферментного раствора.
Величину А рассчитывают по формуле:
,где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см3 опытной пробы, см3;
ак – то же для контрольной пробы;
1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;
К – поправка к титру щелочи.
5 ЖИРЫ
Липиды – это гетерогенная группа соединений, непосредственно или опосредовано связанных с жирными кислотами. Их общими свойствами являются:
1) относительная нерастворимость в воде;
2) растворимость в неполярных растворителях – эфире, хлороформе, бензоле.
В зависимости от химического состава липиды подразделяют на несколько классов:
– простые липиды, включают вещества, молекулы которых состоят только из остатков жирных кислот (или альдегидов) и спиртов; к ним относятся жиры (триглицериды), воски (эфиры жирных кислот и жирных спиртов);
– сложные липиды могут присоединять функциональные группировки с образованием фосфолипидов (остатки фосфорной кислоты), сульфолипидов (остатки серной кислоты), гликолипидов (углеводы), липопротеидов (белки) (Приложения Л, М).
5.1 Лабораторная работа «Определение числа
омыления жира»
Числом омыления называется количество миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации всех, как свободных, так и входящих в состав триацилглицеролов жирных кислот, содержащихся в
1 г жира.
Материалы и реактивы: растительное масло, 0,1 %-ный раствор фенолфталеина; раствор HCl (0,5 моль/л); спиртовый раствор KOH
(0,5 моль/л). Для приготовления этого реактива растворяют 40 г КОH в 30 мл воды, в зависимости от концентрации спиртового раствора берут соответствующее количество водного раствора КОH и разводят перегнанным в присутствии NаОН (на 100 г спирта 5 г NаОH) спиртом. Спирт с таким соотношением NаОН кипятят с обратным холодильником в течение часа, затем перегоняют. Раствор отстаивают сутки, фильтруют и сохраняют в склянке темного стекла, хорошо закупорив (для защиты от углекислоты воздуха).
Оборудование: колбы емкостью 50 мл, обратный холодильник, водяная баня, пипетки, бюретки, капельницы.
Ход работы. В одну колбу (исследуемая проба) помещают 0,5 г растительного масла, в другую (контрольная проба) – 0,5 мл воды.
В обе колбы доливают по 15 мл спиртового раствора КОН и кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 50 мин до полного омыления глицеридов и нейтрализации свободных жирных кислот. Затем в обе колбы доливают по 10 капель раствора фенолфталеина и титруют в теплой воде раствором НС1 до исчезновения розовой окраски (до нейтральной реакции).
Количество КОН (мг) или число омыления (ЧО), которое пошло на нейтрализацию свободных жирных кислот в 1 г жира, равно:
,где (В – А) – разность результатов титрования контрольного и опытного образцов раствором соляной кислоты (0,5 моль/л), мл;
a – навеска исследуемого жира, г;
f – коэффициент поправки на титр раствора НС1 (0,5 моль/л);
Q – количество КОН (28,05 мг), эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,5 моль/л).
5.2 Лабораторная работа «Определение кислотного
числа жира»
Кислотностью жира или кислотным числом называется число миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.
Материалы и реактивы: спирт; нейтрализованный по фенолфталеину; раствор КОН (0,1 моль/л); 0,1 %-ный раствор фенолфталеина, жир (подсолнечное масло).
Оборудование: колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки.
Ход работы. К 1 г растительного масла добавляют 5 мл спирта, нейтрализованного по фенолфталеину, тщательно перемешивают для максимального растворения свободных жирных кислот и титруют раствором КОН до появления не исчезающей после взбалтывании розовой окраски (окраска не должна исчезать в течение 0,5…1 мин).
Количество КОH (мг) или кислотное число (КЧ), которое пошло на титрование свободных жирных кислот в 1 г жира, рассчитывают по формуле:
,где А – объём раствора КОН (0,1 моль/л), израсходованного на титрование исследуемой пробы;
f – коэффициент поправки на титр раствора КОН (0,1 моль/л);
Q – количество КОН (5,61 мг), эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,1 моль/л).
5.3 Определение эфирного числа жира
Эфирным числом называется число миллиграммов едкого калия, небходимое для нейтрализации всех жирных кислот, образующихся при омылении триацилглицеролов, содержащихся в 1 г жира. Это число определяют как разницу между числом омыления данного жира и его кислотным числом.
5.4 Лабораторная работа «Определение йодного числа жира»
Йодным числом называется количество граммов йода, которое прореагировало с 100 г жира. Это число указывает на содержание в жире непредельных жирных кислот.
Определение йодного числа основывается на реакции присоединения йода по месту двойной связи, которая протекает по уравнению:
Материалы и реактивы: растительное масло; эмерсионное масло; спиртовой раствор йода (0,1моль/л); 1 %-ный раствор крахмала; раствор Na2S2O3 (0,5 моль/л).
Оборудование: две конические колбы ёмкостью 50 мл, пипетки, бюретки.
Ход работы. В первую колбу помещают навеску жира от 0,1 до 0,2 г (исследуемая проба), во вторую от 0,1 до 0,2 мл воды (контрольная проба), прибавляют по 10 мл спиртового раствора йода и перемешивают. Через 15 мин содержимое колб оттитровывают раствором Na2S2O3 сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 мл раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания.
Йодное число вычисляют по формуле:
,где (В – А) – разность результатов титрования контрольного и опытного образцов в растворе гипосульфита (0,5 моль/л), мл;
a – навеска исследуемого жира, г;
f – коэффициент поправки на титр раствора Na2S2O3 (0,5 моль/л);
Q – количество йода (12,69 мг), эквивалентное 1 мл раствора Na2S2O3 (0,5 моль/л).
6 ВИТАМИНЫ
Витамины – важнейший класс незаменимых биологически активных веществ. Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует их в недостаточном количестве. В отличие от других незаменимых веществ (аминокислоты и жирные кислоты) витамины не являются пластическим материалом или источником энергии и участвуют в обмене веществ преимущественно как коферменты при биокатализе и регуляторы биохимических и физиологических процессов (Приложение Н).