Методические указания к лабораторным занятиям по биологической химии для студентов II курса медицинского факультета (стр. 5 из 6)
4. Включить прибор в сеть: вилку шнура вставить в розетку электросети, рукоятку 8 - в положение “включено”. Загорается сигнальная лампочка (9). Прибор прогревать 15-20 минут с открытой крышкой кюветного отделения.
5. Поставить кювету с растворителем (или контролем) во второе (дальнее от передней стенки) гнездо кюветодержателя, а кювету с исследуемым раствором - в первое (ближнее) гнездо. Закрыть крышку кюветного отделения.
6. Кювету с растворителем (контролем) поместить в световой поток, повернув рукоятку 4 до упора влево.
7. Установить стрелку микроамперметра на нуль по шкале оптической плотности рукояткой 6 (“установка грубо”). В случае необходимости подвести стрелку к нулю рукояткой 7 (“установка точно”).
8. Переместить в световой поток кювету с исследуемым раствором, повернув рукоятку 4 до упора вправо и записать значение оптической плотности по нижней шкале микроамперметра.
9. Сразу повернуть рукоятки 6 и 7 до упора влево.
10. По окончании работы убрать кюветы и навести порядок в кюветном отделении и у фотоэлектроколориметра, отключить прибор от электросети и вымыть кюветы.
Определение концентрации вещества в растворе
по оптической плотности
Для определения концентрации вещества в окрашенном растворе необходимо построить калибровочную (градуировочную) кривую. С этой целью готовят ряд растворов исследуемого вещества с известными концентрациями (стандартные растворы) и измеряют на КФК-2 их оптическую плотность. Полученные результаты отражают графически: откладывают по оси абсцисс концентрации, а по оси ординат соответствующую им оптическую плотность. Например:
Измерив оптическую плотность исследуемого раствора, нетрудно найти концентрацию вещества по калибровочной кривой.
Оформление работы
После ознакомления с устройством и принципом действия фотоэлектроколориметра определяют оптическую плотность 2-3 окрашенных растворов и записывают результаты.
Техника безопасности
1. До включения прибора в сеть проверить наличие заземления.
2. Не оставлять КФК-2 и гальванометр включенными без надобности.
3. Следить за чистотой прибора.
4. Осторожно обращаться с кюветами.
РАБОТА 11. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ
Белки в щелочной среде реагируют с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.
Ход работы.
1.Построение калибровочной кривой
Готовят семь рабочих стандартных растворов белка разведением основного стандартного раствора (содержит 4 мг белка в 1 мл) дистиллированной водой, как указано в таблице:
| № проб | Стандартный раствор, мл | Н2О, мл | Содержание белка в пробе, мл | Е |
| 1 | 0,25 | 1,75 | 1,0 | |
| 2 | 0,50 | 1,50 | 2,0 | |
| 3 | 0,75 | 1,25 | 3,0 | |
| 4 | 1,00 | 1,00 | 4,0 | |
| 5 | 1,25 | 0,75 | 5,0 | |
| 6 | 1,50 | 0,50 | 6,0 | |
| 7 | 1,75 | 0,25 | 7,0 | |
| Контроль | - | 2,00 | - | - |
Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают
2 мл дистиллированной воды. Во все рабочие стандартные растворы и контроль добавляют по 2,5 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут для развития окраски. Окрашенные стандартные растворы колориметрируют на КФК-2 против контроля в кюветах на 5 мл с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). Полученные значения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.
2. Количественное определение белка в сыворотке крови
Исследуемую сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (1мл сыворотки смешивают с 39 мл Н2О). К 2 мл разбавленной сыворотки добавляют 2,5 мл биуретового реактива и после перемешивания оставляют при комнатной температуре на 30 минут, а затем колориметрируют.
Контрольная проба вместо сыворотки содержит 2 мл дистиллированной воды. Измерение оптической плотности производится так же, как при построении калибровочной кривой.
Оформление работы
1. Записать величины оптической плотности стандартных растворов в виде таблицы:
| № пробы | Содержание белка в пробе (мг) | Е1 | Е2 | Е3 | Еср. |
Е1, Е2, Е3 - значения оптической плотности одного стандартного раствора, полученные разными студентами.
2. Построить калибровочную кривую.
3. Рассчитать содержание белка в исследуемой сыворотке крови и сделать выводы.
Техника безопасности
1. Осторожно наливайте биуретовый реактив, содержащий 10% щелочь натрия.
2. Соблюдайте правила работы на КФК-2.
РАБОТА 12. ВЫДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНА ИЗ МОЛОКА
80% белков молока приходится на долю специфического фосфопротеида казеина. Этот белок обладает кислыми свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении казеин выпадает в осадок в виде белых рыхлых хлопьев, которые легко отделяются фильтрованием.
Ход работы
1. В химический стакан емкостью 50 мл отмеряют мерной пробиркой 3 мл молока и 7 мл дистиллированной воды. К смеси постепенно, слегка перемешивая, добавляют 10-15 капель 1% раствора соляной кислоты до начала образования рыхлого осадка. (Кислоту добавлять аккуратно по каплям, так как в избытке ее осадок казеина растворяется!)
2. Для удаления кислоты в стакан наливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и через 5 минут жидкость осторожно сливают с осадка. К осадку еще раз приливают 10 мл дистиллированной воды, содержимое стакана осторожно перемешивают и через 5 минут фильтруют через бумажный фильтр.
3. Осадок с фильтра переносят стеклянной палочкой в колбочку (небольшую часть осадка оставляют на фильтре и проверяют на биуретовую реакцию). В колбочку приливают 6 мл 10% раствора гидроксида натрия, присоединяют обратный холодильник и нагревают на песочной бане в течение 1 часа.
4. К охлажденному гидролизату добавляют 20-30 капель концентрированной азотной кислоты слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза казеина. После отстаивания жидкость фильтруют.
5. Проделывают с фильтратом биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту:
а) к 0,5 мл фильтрата добавляют 1 мл 10% щелочи и 1 каплю 1% раствора сульфата меди;
б) к 0,5 мл фильтрата добавляют 1 мл молибденового реактива (смесь молибдата аммония и концентрированной азотной кислоты), доводят до кипения и кипятят несколько минут. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет.
При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок (NH4)3РО4. 12МоО3.
Оформление работы
Записывают результаты опытов по выделению казеина из молока и изучению продуктов гидролиза.
Техника безопасности
1. Будьте внимательны при использовании растворов щелочи натрия, соляной кислоты, концентрированной азотной кислоты и молибденового реактива.
2. Соблюдайте правила пожарной безопасности, работая с песочной баней.
РАБОТА 13. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ПРОДУКТЫ ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ДРОЖЖЕЙ
Нуклеопротеиды – сложные белки, простетической группой
которых являются нуклеиновые кислоты. Для качественного анализа химического состава нуклеопротеидов могут быть использованы дрожжи, богатые этими сложными белками. Продукты кислотного гидролиза нуклеопротеидов дрожжей обнаруживают специфическими качественными реакциями.
Ход работы.
1. Взвешивают 2,5 г пекарских дрожжей. Навеску помещают в колбочку и добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты. Колбочку закрывают пробкой, в которую вставлен обратный холодильник, и ставят на песочную баню. Через 1 час после начала кипения жидкости гидролиз прекращают. После охлаждения гидролизат фильтруют через бумажный фильтр.
2. С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов:
а) Биуретовая реакция на полипептиды.
К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди. Жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.
б) Серебряная проба на пуриновые основания.
К 10 каплям гидролизата добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака до щелочной реакции (проверить по индикаторной бумажке, опущенной в пробирку), затем 10 капель 2% аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 минут выпадает рыхлый осадок серебряных соединений пуриновых оснований (аденина и гуанина), окрашенный в светло-коричневый (бурый) цвет.
в) Проба Молиша на пентозу.
К 10 каплям гидролизата добавляют 3 капли 1% спиртового раствора тимола, перемешивают и по стенке пробирки осторожно приливают 20-30 капель концентрированной серной кислоты. После перемешивания развивается красное окрашивание, обусловленное продуктом конденсации тимола с фурфуролом, образовавшимся из пентозы.