Ход работы. Взвешивают 2 г мышечной ткани. Измельченную ножницами навеску помещают в фарфоровую ступку, добавляют
2 мл 5% раствора хлорида калия и растирают со стеклянным песком до гомогенного состояния. К гомогенату добавляют 3 мл раствора хлорида калия и растирают кашицу в течение 5 минут, после чего прибавляют еще 5 мл 5% раствора хлорида калия и продолжают растирание 5 минут.
Полученный гомогенат фильтруют через два слоя марли или центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин.
С фильтратом (или центрифугатом) проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля и Сакагучи).
Оформление работы
Кратко запишите результаты проделанных реакций.
Техника безопасности.
Смотрите в работе 1. “Цветные реакции на белки”.
РАБОТА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯИЧНОГО АЛЬБУМИНА
Яичный белок представляет собой смесь нескольких белков. Примерно 70% яичного белка составляет альбумин, который легко отделяется от глобулинов. При десятикратном разведении яичного белка дистиллированной водой глобулины выпадают в осадок, а альбумин остается в растворе.
Ход работы.
1. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан емкостью 500 мл, затем в стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.
2. Раствор переносят в мерный цилиндр и объем доводят дистиллированной водой до 300 мл. Раствор оставляют на
30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов.
Примечание: работу, описанную в пунктах 1 и 2, выполняет и демонстрирует дежурный студент, приготовленную суспензию затем использует каждый студент в группе.
3. 20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.
4. С фильтратом, содержащим яичный альбумин, проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля).
Кратко запишите результаты проделанных реакций.
Техника безопасности.
Смотрите в работе 1 “Цветные реакции на белки”.
РАБОТА 4. КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ
В процессе гидролиза белков происходит разрыв пептидных связей и молекула белка распадается сначала на высокомолеку-
лярные полипептиды, затем на более простые пептиды и, наконец, на аминокислоты:
Кислотный гидролиз белков проводят в присутствии соляной или серной кислот при кипячении.
Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом изучения первичной структуры белка. В организме гидролиз постоянно протекает в процессе пищеварения и в тканях под действием протеолитических ферментов.
Ход работы. В небольшую колбочку, снабженную обратным холодильником, наливают 2-3 мл 2% раствора альбумина и
15-20 мл 25% раствора серной кислоты. Содержимое колбы кипятят под тягой в течение 60-90 минут. Через каждые полчаса (с момента закипания) с гидролизатом проделывают биуретовую реакцию: для этого к 0,5 мл гидролизата добавляют 30% раствор щелочи до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге и 1-2 капли 1% раствора сульфата меди. Отрицательная биуретовая реакция указывает на полное расщепление белка до аминокислот.
Для сравнения биуретовую реакцию делают с 2% раствором альбумина.
Оформление работы
Записать результаты биуретовой реакции, проделанной с белком и разными по времени гидролиза порциями гидролизата.
Техника безопасности
1. Осторожно обращайтесь с 25% раствором серной кислоты.
2. Будьте внимательны при отмеривании из колбы горячего гидролизата.
3. Соблюдайте правила пожарной безопасности при кипячении раствора белка.
Работа 5. Разделение аминокислот методом
распределительной хроматографии на бумаге
Метод основан на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: воде и органическом растворителе. Водяная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе - целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислот в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота на бумаге.
Положение аминокислот на бумаге можно определить с помощью нингидриновой реакции: в присутствии нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде окрашенных пятен.
Показателем скорости движения аминокислоты является коэффициент распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (точка старта) до середины ее пятна (а) к расстоянию от точки старта до фронта растворителя (в): Rf = а/в. Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).
Существуют различные способы хроматографического разделения смеси аминокислот на бумаге.
1. Радиальная (круговая ) хроматография
Для разделения смеси аминокислот используется растворитель, состоящий из смеси н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5. Приготовленная смесь встряхивается в делительной воронке в течение 5 минут, а затем отстаивается
7-10 часов, после чего нижний слой используется для насыщения хроматографической камеры парами, а верхний - для разделения аминокислот. Хроматографической камерой служит эксикатор.
Ход работы.
1. Хроматографическую бумагу вырезают в форме диска, диаметр которого соответствует внутренним размерам диаметра эксикатора. В центр диска (на точку старта) наносят микропипеткой в несколько приемов 0,005-0,01 мл исследуемой смеси аминокислот. Нанесение смеси следует проводить очень аккуратно, слегка касаясь микропипеткой стартовой точки, чтобы диаметр мокрого пятна был не более 5 мм. После каждого нанесения пятно подсушивают над электроплиткой или в термостате.
2. В центре хроматограмм делают иглой отверстие, в которое пропускают фитилек из сложенной вчетверо нити. Хроматограмму помещают в эксикатор, на дно которого предварительно наливают верхний слой растворителя. Проверяют положение фитилька и хроматограммы: конец фитилька должен быть погружен в растворитель, а края хроматограммы должны находиться на выступах эксикатора. Закрывают эксикатор крышкой.
3. Растворитель поднимается вверх по фитильку, а затем радиально распространяется по бумаге от центра. Когда растворитель достигнет края бумаги, ее вынимают из эксикатора, высушивают под тягой, обрабатывают 0,5% раствором нингидрина (готовится на ацетоне или спирте) и помещают в сушильный шкаф при 60-70оС на 10-15 минут. На хроматограмме появляются сине-фиолетовые пятна, каждое из которых соответствует отдельной аминокислоте.
2. Нисходящая хроматография
В качестве хроматографической камеры используют высокие стеклянные банки с выступом в верхней части. На выступ в строго горизонтальном положении ставят лодочку - специальный стеклянный сосуд для растворителя.
Ход работы.
1. Из хроматографической бумаги вырезают полоску шириной 5 см и длиной, примерно соответствующей высоте камеры. На расстоянии 10 см от конца полоски проводят простым карандашом стартовую линию, в середине которой отмечают точку старта. На стартовую точку микропипеткой наносят 0,005-0,01 мл смеси аминокислот (в несколько приемов, диаметр мокрого пятна не более 5 мм), периодически просушивая бумагу над электрической плиткой (или над настольной лампой).
2. На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество нижнего слоя растворителя, а в установленную лодочку - верхний слой растворителя. Хроматограмму с нанесенной смесью аминокислот помещают в камеру так, чтобы ближний к старту конец был опущен в лодочку и зафиксирован в ней предметным стеклом, а другой висел вертикально, не касаясь стенок камеры. Камеру закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов.
3. Растворитель продвигается по хроматограмме сверху вниз, и когда фронт его приблизится к нижнему краю бумаги, хроматограмму вынимают из камеры и высушивают под тягой. Затем ее обрабатывают 0,5% раствором нингидрина и помещают в сушильный шкаф при 60-70оС на 10-15 минут для развития окраски, после чего на ней появляются пятна сине-фиолетового или лилового цвета, соответствующие аминокислотам.
Оформление работы
1. Зарисовать хроматограммы и хроматографические камеры.
2. Рассчитать коэффициенты распределения аминокислот, разделенных методами радиальной и нисходящей хроматографии на бумаге.
1. Осторожно обращайтесь с растворителем, содержащим бутиловый спирт и ледяную уксусную кислоту. Растворитель обладает резким неприятным запахом, пары его могут вызвать ожоги слизистых.
2. Соблюдайте правила пожарной безопасности при пользовании электрической плиткой и сушильным шкафом.
РАБОТА 6. РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ
Многие белки растворяются в воде, что обусловлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп. Растворимость белка в воде зависит от структуры белка, реакции среды, присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки, обладающие кислыми свойствами, а в щелочной - белки, обладающие основными свойствами.