И коллоидная химия (стр. 9 из 17)
20. Метаболизм этанола, поступающего в организм человека, происходит в печени. В результате двух реакций дегидрирования из 1 молекулы этанола образуются уксусная кислота и 2 молекулы НАДН+Н+. Уксусная кислота превращается в ацетил-КоА и включается в цикл Кребса. Накопление НАД-восстановленного в печеночных клетках приводит к изменению реакций, зависимых от этих эквивалентов. Особенно это выражено у хронических алкого-ликов, при приеме алкоголя натощак или при значительной физической нагрузке. Какие изменения углеводного обмена происходят при этом? Как это отражается на биохимических показателях крови?
21. Сладкий вкус зерен кукурузы в свежесобранных початках обусловлен высоким содержанием в них сахара. Через несколько дней (без специальной обработки) сахаристость кукурузы снижается, так как 50% свободного сахара в зернах превращается в крахмал в течение одного дня хранения. Чтобы сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки помещают на несколько минут в кипящую воду, затем охлаждают и замораживают. В чем биологическая основа этой обработки?
5.2. ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ
РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ИЛЬКА
Цель работы: ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения холестерина в сыворотке крови.
Задачи:
· построить калибровочную кривую по стандартным растворам холестерина;
· определить уровень холестерина в сыворотке крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
В норме количество холестерина в сыворотке крови составляет в среднем 165 мг%.
Обмен холестерина нарушается при ряде заболеваний, особенно при атеросклерозе. Содержание его в крови увеличивается при гипертонии, сахарном диабете, заболевании почек (липоидном нефрите).
Принцип метода. Метод основан на реакции Либермана - Бурхада. При действии концентрированной серной кислоты происходит дегидратация холестерина, конденсация образовавшихся продуктов в виде непредельных углеводородов, соединяющихся с серной кислотой с образованием окрашенных продуктов.
Ход работы
1. Построение калибровочной кривой
В 5 пробирок вносят реактивы в количестве, указанном в таблице:
| № п / п | Количество стандартного раствора холестерина, мл | Количество реактива Илька, мл | Количество холестерина, мг% | Е |
| 1 | 0,05 | 2,05 | 50 | |
| 2 | 0,10 | 2,00 | 100 | |
| 3 | 0,15 | 1,95 | 150 | |
| 4 | 0,20 | 1,90 | 200 | |
| 5 | 0,25 | 1,85 | 250 |
Содержимое пробирок осторожно перемешивают, закрывают пробками и оставляют в темноте на 20 минут. Затем растворы колориметрируют на ФЭКе против реактива Илька в кюветах на 5 мм с красным светофильтром. Полученные значения экстинкции (Е) используют для построения калибровочной кривой, откладывая по оси абсцисс количество холестерина в мг%, по оси ординат – оптическую плотность раствора.
Внимание! При выполнении методики необходимо быть особенно внимательными и осторожными, так как стандартный раствор холестерина приготовлен на концентрированной уксусной кислоте, а в состав реактива Илька входят концентрированная уксусная, концентрированная серная кислоты и уксусный ангидрид (в соотношении 1:1:5). Реактивы набирать только пипеткой с резиновой трубкой и стеклянным наконечником или автоматической пипеткой, не разливать, избегать попадания их на кожу, слизистые и одежду. Во время выполнения анализа пробирки обязательно закрывать пробками, а кюветы – крышками.
Калибровочная кривая
2. Определение содержания холестерина в сыворотке крови
В пробирку вносят 2 мл реактива Илька и 0,1 мл сыворотки крови. Содержимое перемешивают, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 минут, после чего колориметрируют, как при построении калибровочной кривой. Определяют концентрацию холестерина в сыворотке крови по полученной калибровочной кривой.
Результаты:
Общие выводы по работе:
работа 13. определение концентрации общего холестерина в сыворотке и плазме крови энзиматическим методом
Цель работы: ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерина.
Задачи:
· определить содержание общего (свободного и этерифицированного) холестерина в предложенной сыворотке крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
Принцип метода. При гидролизе эфиров холестеридов холестерин-эстеразой образуется холестерин. Общий холестерин (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:
В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина.
Реактивы
Из набора реагентов серии Olvex Diagnosticum готовят перед анализом:
1. Стандартный раствор холестерина – 5,17 ммоль/л (200 мг/дл),
2. Рабочий реагент, содержащий:
а) фосфатный буфер (100 ммоль/л),
б) фенол (20 ммоль/л),
в) холестеринэстеразу (400 U/л),
г) холестериноксидазу (250 U/л),
д) пероксидазу (500 U/л)
Ход работы
В три обычные химические пробирки наливают:
1) в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови,
2) в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерина,
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37 оС. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм.
Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.
Расчет
Расчет количества общего холестерина проводят по формуле:
С = Ео/Ест. ´ 5,17 [ммоль/л] или С = Ео/Ест. ´ 200 [мг/100мл],
где Ео – экстинция опытной пробы,
Ест – экстинция стандарта.
Содержание холестерина в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах:
20-29 лет – 3,72- 7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл),
30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл),
40-49 лет – 4,40- 8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл),
старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл).
Результаты:
Общие выводы по работе:
РАБОТА 14. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КЕТОНОВЫХ ТЕЛ В КРОВИ, МОЧЕ И МОЛОКЕ
Цель работы: ознакомиться с некоторыми реакциями выявления кетоновых тел в биологических жидкостях.
Задачи:
· определить количество кетоновых тел в сыворотке крови, молоке и моче;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют с нитропруссидом натрия в щелочной среде комплексное соединение розово-фиолетовой окраски. Интенсивность окраски зависит от количества кетоновых тел в реакции.
1. Качественная реакция выявления кетоновых тел
Ход работы. На кафель или стекло наносят 0,1-0,2 г порошка нитропруссида натрия, прибавляют 2-3 капли сыворотки крови и выдерживают 5 минут. Появление розово-фиолетовой окраски указывает на положительный результат. Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10 мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно – содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту – в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел.
2. Полуколичественный метод определения кетоновых тел
в сыворотке крови
Ход работы. После качественной реакции сыворотку крови разводят дистиллированной Н2О: при содержании 30-50 мг% делают разведения 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6. Для этого берут 4 пробирки, в которые приливают по 0,1 мл сыворотки крови, в первую пробирку прибавляют 0,3, во вторую – 0,4, в третью – 0,5 и четвертую – 0,6 мл дистиллированной Н2О. Затем проводят качественную реакцию выявления кетоновых тел с нитропруссидом натрия на кафеле или предметном стекле так же, как в пункте 1, только прибавляют не цельную, а разведенную сыворотку крови. В пробе с наибольшим разведением, дающим положительную реакцию, содержится 10 мг% кетоновых тел. Умножая результат на степень разведения, получают содержание кетоновых тел в неразведенной пробе.
Кетоновые тела в свежеполученном молоке и моче определяют так же, как и в сыворотке крови (пункт 1). Следует помнить, что тест более чем в 3 раза чувствительнее при определении ацетоуксусной кислоты, чем ацетона. Из всех кетоновых тел в сыворотке крови человека ацетоуксусная кислота является преобладающей, однако в крови здоровых коров 70-90% кетоновых тел составляет b-оксимасляная кислота, в молоке на ее долю приходится 87-92%.