Методические указания по отдельным видам занятий лабораторная работа №1 (стр. 9 из 16)
Вычислить показатель хлорируемости воды Охл по формуле:
,где Д - доза введенного хлора, соответствующая содержанию остаточного хлора 0,5 мг/л.
По результатам работы написать отчет.
МИКРОБИОЛОГИЯ
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА N 11
УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРИЕМЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
Цели: 1.Знакомство устройством светопольного микроскопа.
2. Приготовление препаратов фиксированных клеток.
3. Знакомство с морфологией микроорганизмов.
Кроме мира, видимого невооруженным глазом, вокруг нас присутствует невидимый мир ничтожно малых живых существ, которые называются микроорганизмами (м/о). Изучением м/ов занимается микробиология.
М/Б - micros-малый, bios-жизнь, logos- учение. Она изучает строение, жизнедеятельность м/ов и изменения, вызываемые ими в окружающей природе. Всякое изучение начинается с морфологии.
МОРФОЛОГИЯ - структура, форма и особенности строения клеток микроорганизмов. Изучение м/о возможно только через микроскоп.
1. ЗНАКОМСТВО С УСТРОЙСТВОМ СВЕТОП. М/П.
М/П - сложный оптический прибор, оптическая часть которого смонтирована на специальный штатив.
колонка (2 винтовые системы) (к колонке подвижно прикрепленыШтатив тубус и столик)
основание2 винтовые системы: - макрометрический винт - позволяет быстро передвигать тубус;
- микрометрический винт- для детальной, более точной установки тубуса.
3 увеличительные системы:
1- объектив (внизу тубуса)- дает действительное изображение рассматриваемого объекта (сила увеличения- 10х, 40х, 90х).
2- окуляр - система увеличительных стекол, с помощью которых происходит увеличение изображения, даваемого объективом (находится в верхнем конце тубуса). Сила увеличения-7х, 10х, 15х раз.
3- линза конденсора (у основания м/п) - система увеличительных стекол, пройдя через которую свет фокусируется на объекте.
Объектив с увеличением 90х - иммерсионный объектив.
ПРАВИЛА РАБОТЫ С ИММЕРСИОННЫМ ОБЪЕКТИВОМ:
1. Устанавливаем объектив с увеличением х20.
Вращая макровинтом и глядя в окуляры, находим колонию микроорганизмов.
2. Установим объектив х90.
На сухой окрашенный препарат наносим каплю иммерсионного масла.
4. Глядя сбоку, осторожно опускают макровинтом тубус м/п до погружения объектива в масло, (следят за тем, чтобы линза не коснулась стекла).
5. Наблюдая в окуляр, макровинтом медленно поднимают тубус и фокусируют объект.
6. Зарисовать все просмотренные препараты. (название препарата на латинском языке).
2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК.
Подготовка препаратов фиксированных клеток.
Фиксированные окрашенные препараты м/ов рассматриваются через
иммерсионный объектив. Их приготовление включает следующие этапы:
1. Приготовление мазка.
2. Высушивание.
3. Фиксация.
4. Окраска.
1. Пробирку с культурой. м/ов берут в левую руку и держат в горизонтальном или в наклонном положении. В правую руку берут бактериальную петлю и прокаливают ее в пламени горелки. Затем вводят в пробирку и, отобрав небольшое количество микробной массы, наносят на предметное стекло.
2. Высушивание - при комнатной температуре на воздухе. 3.Фиксация преследует несколько целей:
а) обеспечить прикрепление клеток к стеклу;
б) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше;
в) сделать безопасным дальнейшее обращение с мазком.
Фиксацию клеток осуществляют термической обработкой - препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени спиртовки.
4. Окрашивание - для простого окрашивания будем использовать генциановый фиолетовый. Фиксированный препарат помещают на 2 // стеклянные палочки, соединенные резиновым шлангом. Помещаем на края кюветы и заливаем красителем на 2-3 минуты.
По окончании окраски препарат промывают водой (пока вода не станет прозрачной). Препарат высушивают на воздухе.
РАССМАТРИВАЕМЫЕ ПРЕПАРАТЫ.
1. STREPTOCOCCUS LACTIS.
2. LACTOBACTERIUM ACIDOPHILUM.
3. SACCHAROMYCES.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12
МЕТОДЫ УЧЕТА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
1. Учет численности микроорганизмов в почве методом питательных пластин в сочетании с методом последовательных разведений
Почва — наиболее благоприятная среда для развития микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого участка берут среднюю почвенную пробу.
Сначала готовят суспензии (методом разведения), содержащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фломбируют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим стерильным часовым стеклом.
Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтывают 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10-2 г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10-3 г, во второй колбе — 10-4 г. Точно так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10-5 и 10-6 г почвы.
Для определения численности микроорганизмов в каждом разведении методом питательных пластин можно провести глубинный или поверхностный посев. Последний - более сложный и занимает больше времени. Поэтому для подсчета численности бактерий в почве методом питательных пластин можно ограничиться глубинным посевом, а поверхностный использовать при учете численности различных физиологических групп микроорганизмов на плотных средах.
Для определения количества живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого разведения, берут по 1 мл этих суспензий и переносят в стерильные чашки Петри, используя всякий раз новую стерильную пипетку. На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Затем в чашки Петри вливают расплавленный МПА, заранее приготовленный и разлитый в пробирки на 20 мл (2/3 объема) из расчета одна пробирка на чашку. Температура агара должна быть примерно 45 °С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленным агаром к щеке: если щеке не горячо — среду можно вылить в чашку Петри. Осторожными круговыми движениями чашки, не смачивая крышку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на его поверхность конденсационной влаги с крышки, и помещают в термостат при 28—30 °С.
Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба. Через 48 ч инкубации чашки вынимают из термостата и предварительно подсчитывают число колоний. В связи с тем что существуют медленнорастущие формы бактерий, окончательный подсчет делают на 5-е сут.
Количество КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, умножая число колоний в чашке на степень разведения — число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. Казалось бы, во всех вариантах посева должно получиться примерно одинаковое число КОЕ, однако Практике происходит не так.
Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются, что часто наблюдается в чашках при разведении 10-2. При высоких разведениях вырастают единичные колонии (меньше 10 на чашке), которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха при внесении в чашку почвенной суспензии или питательной среды. Учет таких чашек сделает подсчет недостоверным. Для правильного определения численности КОЕ подсчитывают только чашки, в которых колоний свыше 10 и не более 250—300 (в последнем случае при условии, если колонии очень мелкие).
При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учитывать одни и те же колонии, подсчитанные отмечают чернилами или тушью. Чтобы пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Можно использовать и специальный прибор для подсчета колоний.
Бывают случаи, когда в последнем разведении (10-б) число колоний значительно больше 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет выполняют, учитывая, что он дает представление о минимальной численности микроорганизмов в почве.
Метод питательных пластин легко выполним, но ряд недостатков, самый существенный из которых — отсутствие универсальной среды для развития всех микроорганизмов, обитающих в почве. Питание у разных бактерий специфично, и на каждой среде выявляется довольно узкая физиологическая группа. Так, на МПА развиваются в основном гнилостные бактерии, способные усваивать легко доступные органические формы азота. Нитрифицирующие, целлюлозоразрушающие, азотфиксирующие и другие бактерии на этой среде не развиваются. Для более полного представления о населенности делают посевы на элективные среды или используют| метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом.