Методические указания по отдельным видам занятий лабораторная работа №1 (стр. 13 из 16)

2. Со стерильной пипетки удаляют оберточную бумагу и 0,5 (или 1) мл исследуемой воды набирают в пипетку через ватный фильтр в кончике пипетки. Затем исследуемую воду вносят в чашку Петри со слегка приподнятой крышкой на застывший мясо-пептонный агар и распределяют по всей поверхности питательной среды стерильным стеклянным шпателем.

3. Чашки Петри с посевами ставят в термостат на 48 часов при 37°С+-0,5°С.

Через двое суток производится подсчет выросших колоний бактерий в определенном объеме воды и определяется микробное число.

При санитарно-бактериологическом анализе воды определяются

1. МИКРОБНОЕ ЧИСЛО - общее количество бактерий в 1 мл воды.

2. КОЛИ - ТИТР - количество мл воды (наименьший объем), в которой содержится одна кишечная палочка

3. КОЛИ - ИНДЕКС - показывающий количество кишечных палочек в 1 л воды,

Коли-индекс = 1000/коли-титр

По ГОСТ 2874-82:

микробное число питьевой воды должно быть не более 100,

коли-титр - не менее 300,

коли-индекс - не более 3.

2. Определение коли-титра и коли-индекса

Кишечная палочка — самый многочисленный и постоянный обитатель толстого отдела кишечника человека и всех теплокровных животных. Она выделяется во внешнюю среду с фекальными массами, поэтому используется как индикатор фекального загрязнения внешней среды и косвенный показатель наличия в воде болезнетворных микробов — возбудителей кишечных инфекций человека, выделяемых с фекалиями в воду и другие объекты.

Таким образом, кишечная палочка служит санитарно-показательным микроорганизмом воды. Поскольку она не образует спор и гибнет при относительно щадящих методах обеззараживания, ее присутствие в консервированных продуктах или воде указывает на нарушение режима консервирования и на недостаточность обработки воды, так как если кишечная палочка сохранила жизнеспособность, значит, могли выжить и другие неспорообразующие бактерии, такие, как дизентерийная шигелла, брюшнотифозная сальмонелла и другие патогенные бактерии — возбудители желудочно-кишечных заболеваний.

Коли-индекс (индекс кишечной палочки) — это число кишечных палочек, обнаруженных в 1 л исследуемой воды (по международным стандартам — в 100 мл).

По существующим нормативам коли-титр питьевой воды не должен быть менее 333мл (в Москве — не менее 500 мл), а коли-индекс — не более 3.

Коли-титр определяют методами бродильных проб. Данные методы основаны на способности кишечной палочки теплокровных животных и человека развиваться при повышенных температурах (43—44 °С) и сбраживать сахара (маннит, глюкозу и др.) с выделением газа. Существуют двух- и трехэтапные бродильные методы.

Трехэтапный бродильный метод заключается в следующем. На первом этапе ставят первую бродильную пробу: различные разведения исследуемой воды при помощи стерильных пипеток вносят в колбы и пробирки со специальными углеводными жидкими средами (среда Булира, среда Эйкмана, розоловая и др.) и поплавками.

В зависимости от предполагаемого микробного загрязнения водоисточника применяют разные схемы посева. Так, при исследовании водопроводной воды делают посевы в общем объеме 300 мл (2 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл). Воду городов Москвы и Санкт-Петербурга засевают в объеме 500 мл (4 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл). При исследовании воды открытых водоемов (речной, озерной и т. д.) необходимо посеять воду в общем объеме 111,1 мл (1 объем — 100 мл; 1 объем — 10 мл и по одному объему в 1 мл и 0,1 мл). Соотношение между средой и засеваемой водой должно быть 1 : 2. Поэтому посевы малых количеств воды (1 мл, 0,1 мл) выполняют в пробирки с разведенной средой (обычной концентрации), а большие объемы воды (100 мл и 10 мл) — в концентрированную среду.

Посевы выращивают в термостате при 43—44°С в течение 24 ч. При указанной температуре подавляется развитие микроорганизмов, не имеющих санитарно-показательного значения для воды. Затем просматривают посевы для выявления признаков роста кишечной палочки (наличие пузырьков газа в поплавках, изменение цвета, помутнение).

На втором этапе для подтверждения правильности обнаружения роста кишечной палочки в жидкой среде из посева с признаками роста при помощи бактериальной петли делают высев в чашки Петри со средой Эндо и выращивают культуру при 37 °С 24 ч.

Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и обесцвеченного индикатора (фуксин обесцвечен сульфитом натрия). На данной среде бактерии группы кишечной палочки теплокровных животных образуют типичные темно-красные, ярко-красные или грозовые колонии с темным центром, имеющие металлический блеск или без него. Столь характерный рост на среде Эндо этих бактерий обусловлен тем, что они активно сбраживают лактозу, продукты расщепления которой вызывают восстановление индикатора фуксина, окрашивающего колонии. При отсутствии характерного роста на пробу дают отрицательный ответ.

При наличии типичных колоний из них делают мазки, которые окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках обнаруживают мелкие неспорообразующие грамотрицательные палочки, то переходят к третьему этапу для окончательного подтверждения результатов исследования.

На третьем этапе из типичных колоний, в которых при микроскопировании обнаружены характерные микробные клетки, делают пересев в разведенную жидкую углеводную среду (Булира, Эйкмана и др.)- Посевы выращивают при 43— 44°С в течение 24 ч, после чего учитывают окончательно. При наличии в посевах помутнения, газообразования и изменения цвета дают положительный ответ, результаты которого выражают в виде коли-титра. При отсутствии газообразования дается отрицательный ответ, т. е. данные первой бродильной пробы подтверждаются.

Коли-индекс определяют методом мембранных фильтров. Для этой цели используют мембранные фильтры № 3 (ультрафильтры) — пористые пленки, изготовленные из микроклетчатки (нитроцеллюлозы), с диаметром пор 0,7 мкм. Перед фильтрацией их подвергают стерилизации двойным кипячением в дистиллированной воде в течение 15—20 мин. Затем стерильным пинцетом фильтры помещают на предварительно профламбированную поверхность фильтровального прибора Зейтца. Через фильтр Зейтца проводят фильтрацию под вакуумом определенного количества исследуемой воды (через один мембранный фильтр — не более 100 мл воды).

По окончании фильтрации освобождают фильтровальную пластинку, частично разбирая прибор. При помощи стерильного пинцета фильтр кладут осадком вверх на поверхность среды Эндо, залитой в чашку Петри, плотно прижимая к среде. В одну чашку можно поместить 4—5 фильтров. После культивирования в термостате при 37°С в течение 18—24 ч подсчитывают выросшие на фильтре колонии, характерные для группы кишечной палочки. Из 2—3 колоний, типично окрашенных и бесцветных, берут материал для мазков, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Если в мазках присутствуют мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, из оставшейся части колонии делают пересев в пробирки с небольшим объемом жидкой углеводной среды (среда Булира или др.). Посевы выращивают при 43—44°С в течение 24 ч. Наличие газообразования — последний показатель присутствия бактерий группы кишечной палочки.

Материалы и оборудование:

Среда Булира в пробирках с поплавками, стерильные моровские пипетки на 1 мл, стерильные чашки Петри, среда Эндо агаризованная, простерилизованная вода в пробирках по 9 мл, образцы воды для исследования.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЫ

Цель работы: ознакомиться с методикой выполнения санитарно-бактерио-логического анализа.

5.1. Теоретическая часть

Одним из видов анализа природных вод является санитарно-бактериологический. При этом анализе определяются следующие показатели: микробное число, коли-титр, коли-индекс. Микробное число показывает общее количество бактерий в 1 мл воды, развивающихся на питательной среде - мясопептонном агаре (МПА) при t = 37±0,5°С в течение 24 ч. По ГОСТ 2874-73 микробное число не должно превышать 100.

Коли-титр показывает количество миллилитров воды, в котором содержится одна кишечная палочка Coli. По ГОСТ 2874-73 коли-титр должен быть не менее 300 мл. Эта величина, обратная коли-индексу, представляет собой следующее соотношение:

По ГОСТ 2874-73 коли-индекс не должен быть более 3.

К группе кишечной палочки относятся неспороносные, аэробные, грамотрицательные (не окрашиваются по Граму), оксидазоотрицательные бактерии, сбраживающие глюкозу с образованием альдегидов, кислоты и газа.

Эти виды микробов развиваются на фуксин-сульфитном мясопептонном агаре (среда Эндо) с образованием красных колоний с металлическим блеском или темно-красных и розовых с темным центром.

Механизм действия среды состоит в следующем: фуксин, содержащийся в среде, обесцвечивается добавляемым к среде сульфитом натрия и переходит при этом в бесцветное лейкосоединение. При выращивании кишечных палочек они разлагают имеющийся в среде молочный сахар или глюкозу с образованием альдегидов, которые вступают в реакцию с сульфитом натрия, при этом фуксин освобождается и восстанавливается его окраска.

5.2. Экспериментальная часть

Большое значение в санитарно-бактериологическом анализе имеет стерильность посуды и тех сред, которые используются при определении микробного числа и коли-титра.

Стерилизацию проводят за I-2 дня до работы.

Перед стерилизацией всю посуду для отбора проб воды (пипетки, пробирки, колбы) и выращивания колоний (чашки Петри) тщательно вымыть, высушить, закрыть ватными пробками, обернутыми в марлю (кроме чашек Петри) и завернуть каждую вещь отдельно в бумагу или уложить в бумажный пакет.

Стерилизация производится сухим жаром в сушильном шкафу в течение одного часа при температуре 160°С или путем обжига в пламени спиртовки. Фильтровальный прибор, кончики пипеток и пинцетов можно стерилизовать в племени ватного тампона, смоченного спиртом.