Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Метиленовый синий — лучший краситель для молочнокислых бактерий молока, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо — клетки микроорганизмов. На препарате преобладают мелкие округлые клетки Lactococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Эта бактерия — возбудитель естественного скисания молока в средних широтах. Оптимальная температура для ее развития — 30°С. Она способствует накоплению в молоке до 1% молочной кислоты.
Нередко на препарате видны разных размеров тонкие палочки обычно правильной формы рода Lactobacillus, иногда содержащие зерна волютина. Чаще встречается Lactobacillus bulgaricus — возбудитель естественного скисания молока в южных широтах. Оптимальная температура ее развития — 40°С, она кислотоустойчива, накапливает до 3,5% молочной кислоты. На плотных средах эта бактерия образует мелкие характерные колонии в виде комочков ваты, как правило, выпуклые, непрозрачные, непигментированные.
Если на поверхности прокисшего молока появилась пленка, то в мазке обнаруживается также и молочная плесень. Прямоугольные или овальные клетки ее отличаются от молочнокислых бактерий большими размерами.
Можно приготовить также фиксированные препараты из кисломолочных продуктов (йогурта, кефира, ацидофилина, ряженки, бифидока и др.) и зарисовать доминирующие формы. Препараты из силоса или квашеной капусты готовят следующим образом: сначала втирают в предметное стекло кусочек силосуемой массы (или капусты), подсушивают и фиксируют над пламенем горелки. Остывший препарат окрашивают эритрозином (он в отличие от фуксина не окрашивает растительные элементы). И в силосе, и в квашеной капусте преобладают тонкие, хорошо прокрашивающиеся палочки L. plantarum.
Определение количества и качественные реакции на молочную кислоту. Количество молочной кислоты устанавливают по разности между объемами 0,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование молока в конце опыта, и при его постановке.
Для титрования берут 5—10 мл (лучше 10 мл) свежего или прокисшего молока, помещают его в колбу Эрленмейера 100 мл, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1-2 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо-розовой окраски. Если на поверхности прокисшего молока образовалась пленка, то, прежде чем взять сгусток, ее сдвигают пипеткой или стеклянной палочкой в сторону, затем разбивают сгусток, постукивая колбой о ладонь.
Кислотность молока выражают в градусах Тернера (°Т) или в процентах молочной кислоты. Так, 1 °Т соответствует 1 мл 0,1 н. раствора щелочи, пошедшей на титрование 100 мл молока. Следовательно, если на титрование 10 мл молока пошло х мл щелочи, то для выражения кислотности молока в градусах нужно значение х умножить на 10.
Чтобы выразить кислотность в процентах молочной кислоты, количество 0,1 н. раствора NaOH (в мл), потраченное на титрование 100 мл молока, умножают на 0,009, так как 1 мл NaOH нейтрализует эквивалентное количество молочной кислоты. Молекулярная масса молочной кислоты составляет 90. Для приготовления 1 л 1 н. раствора требуется 90 г кислоты. В 1 л 0,1 н. раствора содержится 9 г, а в 1 мл - 0,009 г молочной кислоты.
После определения титруемой кислотности оставшееся скисшее молоко отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. Фильтрат используют для качественных реакций на молочную кислоту.
Для проведения реакции «серебряного зеркала» молочную кислоту превращают в уксусный альдегид. Реакция происходит в кислой среде при температуре кипения в присутствии КМпО4. Результатом взаимодействия уксусного альдегида с аммиачным раствором серебра является образование металлического серебра (серебристое окрашивание).
Последовательность проведения этой качественной реакции на молочную кислоту следующая. В коническую колбу на 100 мл набирают пипеткой 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на асбестовой сетке до начала кипения, периодически взбалтывая. Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5 мл 5%-ного раствора КMnО4, который при этом обесцвечивается. В результате молочная кислота превращается в уксусный альдегид.
Происходящие химические реакции можно выразить следующими уравнениями:
2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 + ЗН2О + 5О
5СН3СНОНСООН + 5О = 5СН3СНО + 5СО2 + 5Н2О
Для распознавания уксусного альдегида горлышко колбы без промедления накрывают фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором AgNO3.
Аммиачный раствор нитрата серебра готовят следующим образом: к 1—2 мл 10%-ного раствора AgNO3 в пробирке добавляют по каплям аммиак: сначала появляется осадок Ag2O, который затем растворяется в избытке аммиака.
Аккуратно, чтобы не разорвать, фильтровальную бумагу прижимают к краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, реагируя с аммиачным раствором AgNO3, вызывает почернение бумаги, имеющее серебристый оттенок, — это выделяется металлическое серебро.
Другой качественной реакцией на молочную кислоту служит реакция с тиофеном. Для ее проведения в пробирку к 1-2 мл фильтрата прибавляют 5 мл концентрированной кислоты и 0,5 мл насыщенного раствора CuSO4. Смесь взбалтывают, нагревают 5 мин на водяной бане при 100°С и после охлаждения добавляют к ней несколько капель спиртового раствора тиофена. В присутствии молочной кислоты наблюдается вишнево-красное окрашивание. Реакция очень чувствительна и специфична.
Материалы и оборудование:
Свежее молоко, колбы на 100 мл, цилиндры на 100 мл, пипетки на 5 и 10 мл, 0,1 н. раствор NaOH, фенолфталеин, треножники с сеткой, и все необходимое для приготовления препаратов, воронки, 10%-ный раствор AgNO3, 13%-ный раствор NH4OH, H2SO4 (плотность 1,84); 0,2%-ный спиртовой раствор тиофена, 5%-ный КМпО4, метиленовый синий.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 15
САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ
Цель работы:
Знакомство с методикой выполнения санитарно-бактериологического анализа воды.
Определение микробного числа в питьевой водопроводной воде методом прямого посева.
Степень микробного загрязнения воды важно учитывать в технологии пищевых производств. Вода, поступающая на производство, по качеству должна соответствовать санитарным нормам. Для контроля за санитарным состоянием такой воды регулярно проводят ее микробиологический анализ. Водопроводную воду исследуют не реже одного раза в месяц, артезианскую — не реже одного раза в год, воду открытых водоемов и колодцев — ежедневно.
Пробы воды для микробиологического исследования отбирают с соблюдением правил асептики (стерильности) в стерильную стеклянную посуду с притертыми или ватно-марлевыми пробками. Перед взятием пробы из водопроводного крана, трубы или колодца с насосом воду спускают в течение 5-10 мин, а края спускной трубы перед набором воды обжигают пламенем. Из открытых водоемов пробы воды отбирают при помощи специальных приборов — батометров — на расстоянии 10—15 см от дна. В проточных водоемах пробы отбирают около берега и в центре течения.
При обычном плановом санитарном контроле было взято не менее 500 мл воды, для исследования на присутствие патогенных микроорганизмов — не менее 1 л. Пробы отбирают в часы наибольшего расходования воды на предприятии. Микробиологический анализ воды выполняют не позднее 2 ч с момента взятия пробы. В исключительных случаях допускается удлинение срока до 6 ч при обязательном хранении проб при низких положительных температурах (1—5°С). При транспортировке в теплое время года пробы предохраняют от нагревания, а в зимнее время — от замораживания.
При санитарно-микробиологическом исследовании воды определяют микробное число и количество бактерий группы кишечной палочки (коли-титр).
1. Определение микробного числа
Микробное число — общая микробная загрязненность — определяется числом микробных колоний, которые вырастают на простой питательной среде (МПА) при 37 °С в течение 24 ч из посева 1 мл исследуемой пробы воды.
Данный показатель позволяет учитывать не все микроорганизмы, содержащиеся в 1 мл воды, а лишь способные расти на простых средах при указанной температуре (мезофильные, сапротрофные). Однако число сапротрофных микроорганизмов, вырастающих на МПА, обычно соответствует степени загрязненности воды органическими веществами и, таким образом, косвенно характеризует ее санитарное состояние.
Для определения микробного числа делают посевы с соблюдением правил асептики в чашки Петри с МПА методом заливки с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Поэтому из проб артезианской и водопроводной воды (содержащей обычно меньше микроорганизмов) высевают соответственно объемы в 1 мл и 0,1 мл из неразведенных проб. При исследовании воды открытых водоемов высевают по 1 мл из предварительно приготовленных в стерильной воде девятикратных разведений исследуемой пробы (10-1—10-3 и более, в зависимости от предполагаемого загрязнения).
Указанные выше объемы проб воды (1 мл, 0,1 мл) или ее разведений (по 1 мл каждого) вносят стерильной пипеткой в пустые стерильные чашки Петри, в которые затем наливают расплавленный теплый МПА (с температурой не выше 45 — 46°С). Воду и МПА тщательно перемешивают и после застывания среды посевы выращивают в термостате при 37°С в течение 24 ч. Затем подсчитывают микробные колонии.
Общее число микробных колоний, выросших на всей чашке Петри, умножают на разведения, из которых был сделан высев 1 мл (чтобы перевести на 1 мл исследуемой воды). Затем определяют среднее арифметическое число колоний — микробное число исследуемой пробы.
ХОД ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:
1. Пробы хлорированной водопроводной воды в количестве 500 мл отбирают в стерильные колбы, в которые до стерилизации вносят по 10 мл 10%-ного раствора сульфида натрия, восстанавливающего активный хлор, находящийся в воде.