Второй недостаток метода питательных пластин - вероятность неполного учета клеток в образце в связи с тем, что в одном месте в агаре может застыть не одна, а несколько клеток. Образованные ими колонии сливаются, создавая впечатление одной колонии. Если такие колонии имеют неоднородную структуру, можно внести поправку при подсчете, приготовив них окрашенный препарат. Если под микроскопом обнаруживаются разные формы клеток, например кокки, палочки и сарцины, то считают, что это не одна колония, а, как в данном примере, три. Если все формы клеток одинаковые, то расценивают колонию как результат развития одной клетки (хотя в этом месте одинаковых клеток могло быть 5, 10 и более). Для сравнения количества КОЕ в разных почвах необходимо подсчитать их число в 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в отдельный бюкс (металлический или стеклянный), высушенный до постоянной массы, берут навеску (5—10 г) для определения влажности почвы. Сушат почву при 105 °С до постоянной массы. Для определения числа КОЕ в 1 г сырой почвы определяют разность между массами сырой и сухой почвы, делят ее на массу навески и умножают на 100. Затем число клеток в 1 г сырой почвы надо разделить на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.
Пример расчета.В1г сырой почвы содержится 5600 клеток. При влажности почвы 30% это число клеток будет соответствовать 0,7 г абсолютно сухой почвы. Определяем численность клеток в 1 г абсолютно сухой почвы:
0,7 г абсолютно сухой почвы содержат 5600 клеток
1,0 г » » х
Таким образом, в 1 г абсолютно сухой почвы содержится 8 тыс. живых клеток.
2. Учет численности КОЕ в воде и других жидкостях
Число микроорганизмов в воде, навозной жиже, огуречном рассоле и других жидких субстратах можно определять различными методами. Если исследование ведут, пользуясь методом питательных пластин, то сначала воду и другие исследуемые жидкости 3 мин хорошо взбалтывают. Затем берут стерильной пипеткой 1 мл жидкости и вносят ее в 99 мл стерильной водопроводной воды. Это — исходное разбавление субстрата в 100 раз. Другой стерильной пипеткой набирают 10 мл исходного разведения и вносят в 90 мл воды, взбалтывают 5 мин и далее готовят методом разведения разные концентрации исследуемой жидкости и определяют число КОЕ в 1 мл, как в пункте 1.
3. Учет численности КОЕ в воздухе
При определении числа микроорганизмов в воздухе его определенный объем пропускают через пробирку с 10 мл стерильной водопроводной воды. Для этого ее закрывают стерильной пробкой с двумя стеклянными трубками. Одну трубку, сообщающуюся с воздухом, опускают в воду до дна пробирки, а отверстие другой, соединенной с аспиратором, находится сразу под пробкой. По количеству воды (в литрах), выпущенной из аспиратора, устанавливают объем воздуха, прошедшего через стерильную воду в пробирке.
При прохождении воздуха через воду микроорганизмы остаются в воде, и их численность затем определяют после приготовления соответствующих разведений методом питательных пластин, как было описано выше. Зная объем воздуха, прошедшего через воду, делают пересчет на 1 м3 воздуха.
Для определения количества КОЕ в воздухе можно использовать и более простой, но менее точный метод Коха (осаждение клеток микроорганизмов на плотных питательных средах). Суть его сводится к следующему. Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА, МПЖ или кусок вареной картофелины) открывают в исследуемом помещении (или на исследуемой площади) на 5 мин. Частицы пыли с бактериями под действием силы тяжести оседают на поверхность плотной питательной среды. Через 48 ч инкубации при 28—30°С осевшие бактерии образуют на среде колонии, которые можно подсчитать. Поскольку некоторые микроорганизмы развиваются медленно, окончательно подсчитывают колонии на 5-е сут.
На площади в 100 см2 за 5 мин осаждается примерно столько клеток, сколько их находится в 10 л воздуха (0,01 м3). Зная площадь чашки Петри, можно подсчитать количество клеток в 1 м3 воздуха. Для этого число колоний, выросших в чашке Петри, относят к общей площади чашки, затем пересчитывают, сколько таких колоний поместилось бы на 100 см и далее — в 1 м3 воздуха.
Пример расчета. В чашке Петри диаметром 10 см выросло 45 колоний. Площадь чашки (πr2) составит 3,14 • 52 = 78,5 (см2). Далее подсчитывают число клеток на 100 см2 (равнозначных 10 л, или 0,01 м3 воздуха:
78,5 см2 воздуха содержат 45 клеток
100,0 см2 » » х
Таким образом, в 0,01 м3 воздуха находится 57 клеток, а в 1 м3 их будет в 100 раз больше — 5700.
В исследуемых помещениях чашки Петри с агаром лучше размещать по 2—3. После подсчета колоний в каждой чашке выводят их среднее арифметическое значение.
Материалы и оборудование:
Часовые стекла, шпатели, ложки, почва, стерильные колбы на 250 мл со 100 мл и стерильные пробки с 9 мл водопроводной воды, стерильные пипетки Мора на 1 мл, колбы с расплавленным МПА, стерильные чашки Петри, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Формы клеток на примере представителей рода Saccharomyces, мукоровых и плесневых грибов.
Объектами микробиологии служат многие виды микроскопических грибов.
Грибы относятся к эукариотам. Тело гриба состоит из мицелия, или грибницы, — сплетения тонких ветвящихся нитей — гиф.
Зигомицеты. Низшие грибы, имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий. Размножаются как половым путем, так и бесполым, т. е. при помощи спор.
Представитель класса — мукор (Mucor mucedo) развивается в виде войлочного белого или серого налета на продуктах растительного происхождения и навозе травоядных животных.
Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и частично стелется по его поверхности. Вверх от грибницы отходят особые воздушные гифы— спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Вздутия представляют собой спорангии, в дальнейшем они отделяются от спорангиеносцев перегородкой. В спорангиях бесполым путем образуются многочисленные спорангиоспоры — эндоспоры (от греч. endon — внутри).
Перегородка, отделяющая спорангий от спорангиеносца, расположена куполообразно, поэтому верхняя часть спорангиеносца оказывается внутри спорангия. Этот участок спорангиеносца называется колонкой и у разных видов мукоровых грибов имеет различную форму (грушевидную, шаровидную, цилиндрическую).
Для просмотра мукоровых грибов следует осторожно взять препаровальной иглой небольшое количество мицелия и другой препаровальной иглой снять его на сухое предметно стекло. Препарат сначала рассматривают без покровного стекла при малом увеличении микроскопа. Видны спорангиеносцы, и круглые темные шарики на их концах — спорангии. Обычно они покрыты тонкими шипами из кристаллов оксалата кальция. Затем на поверхность препарата наносят каплю воды, накрывают его покровным стеклом. Оболочка спорангия при этом разрушается, и споры выпадают. Препарат рассматривают последовательно при малом и большом увеличениях (без иммерсии).
Представители рода Мисог могут быть выделены из почвы при посеве пылевидных ее частиц на поверхность сусло-агара в чашках Петри или из свежего конского навоза, помещенного на 3—4 дня под стеклянный колпак на тарелку с влажной фильтровальной бумагой или сырым песком.
Аскомицеты, или сумчатые грибы. Высшие грибы с многоклеточным или членистым мицелием, образующие споры в сумках — асках. Они включают представителей эуаскомицетов (истинных аскомицетов), у которых сумки со спорами формируются в результате полового процесса на поверхности или внутри плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия (возможно бесполое размножение экзогенно возникающими спорами — конидиями), и гемиаскомицетов, у которых плодовые тела отсутствуют. К гемиаскомицетам относят большинство дрожжей, рассматриваемых отдельно.
Эуаскомицеты включают два важнейших рода почвенных грибов — Penicillium и Aspergillus, которых нередко называв также плесневыми грибами. К группе плесневых относят и некоторых представителей зигомицетов и несовершенных грибов.
Пенициллы и аспергиллы имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий. Размножаются преимущественно конидиальным спороношением. Наблюдаются в виде налета голубого, зеленого, сизого, реже других цветов на продуктах растительного происхождения (варенье, томатной пасте, лимонах и апельсинах), отсыревших изделиях из кожи, обоях. Распространены в верхних горизонтах почвы.
Грибы рода Penicillium называют кистевиками, так как они образуют конидии на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоминающих кисть руки. Иногда отдельный пучок конидиеносцев, выходящих из одной точки и отчленяющих конидии, напоминает рисовальные кисти.
Для рассмотрения строения конидиеносцев Penicillium glaucum препаровальной иглой вырезают кусочек мицелия (приблизительно 0,5 мм2) на границе между его зеленым и белым участками. (Гриб к занятию выращивают в чашке Петри; старые грибы с полностью зеленым мицелием не годятся для просмотра.) Осторожно с помощью двух препаровальных игл кусочек мицелия снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло. Сверху на мицелий кладут покровное стекло. Поскольку мицелиальная пленка гриба довольно толстая, может получиться так, что под покровным стеклом вода не будет целиком окружать исследуемый мицелий. В этом случае надо из капельницы добавлять воду под покровное стекло до тех пор, пока кусочек мицелия не будет со всех сторон окружен водой. Затем слегка надавливают на покровное стекло в центре стеклянной палочкой (или препаровальной иглой). Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой.