работа по биоинформатике на тему Поиск белков-мишеней циклопентеноновых простагландинов (стр. 2 из 4)

Известно, что DBD у всех ядерных рецепторов состоит из двух цинк-фингерных доменов. В SwissProt домен, связывающийся с ДНК, несмотря на этот факт, рассматривается единое целое. Это связано с высокой степенью консервативности, демонстрируемой этим доменом. Мы также не рассматривали этот домен как два различных.

2. Построение филогенетических деревьев белков семейства ядерных рецепторов.

Критерием отбора белков была принадлежность последовательности семейству стероидных/тироидных рецепторов, либо рецепторов ретиноевой кислоты, либо PPAR. Другим условием отбора была видовая принадлежность белков (Homo sapiens).

Затем мы построили филогенетические деревья для найденных последовательностей: по полной последовательности (рис. 3) и по домену, связывающемуся с ДНК (в дальнейшем DBD) (рис. 4). Домены были выявлены из записей SwissProt.

Все обозначения последовательностей, принятые в рисунках 3 и 4 соответствуют Entry name последовательностей в SwissProt. Расшифровки обозначений с указанием полного имени, длины последовательности в аминокислотных остатках, веса белка в килоДальтонах и другой информации помещены в таблицу (см. приложение 2).

Рисунок 3. Филогенетическое дерево полных последовательностей ядерных рецепторов.

Рисунок 4. Филогенетическое дерево DBD ядерных рецепторов.

Рисунки 3 и 4 отражают в целом идентичную картину, различия в них обусловлены наличием в полной последовательности других доменов с незначительной относительной гомологичностью. При этом рецепторы тироидных гормонов (на рисунках THB1, THA) гораздо ближе к PPAR, чем к рецепторам стероидных гормонов.

Видно, что рецепторы стероидных гормонов выделились в группу, наиболее удаленную ото всех остальных (рис. 3, 4).

Интересным фактом является то, что Х-рецепторы ретиноевой кислоты, которые связываются с лигандом как гетеродимер в паре с PPAR

, на дереве, построенном для DBD, располагаются близко к PPAR, в то время как на дереве полных последовательностей они ближе к стероидным рецепторам (рис. 3 и 4). По-видимому, это отражает тот факт, что вышеназванные рецепторы имеют схожие механизмы связывания с ДНК и совершенно различные механизмы связывания со своими лигандами.

Общей же картиной является разделение рецепторов в зависимости от того, с каким лигандом они связываются, все последовательности разделились на группы эстрогеновые рецепторы- Х-рецепторы ретиноевой кислоты- тироидные рецепторы- PPAR и так далее.

При проведении выравниваний мы обнаружили значительную консервативность в области DBD, в то время как в области LBD подобной картины не наблюдалось. Исходя из этого, мы заключили, что функциональное сходство рецепторов стероидных/тироидных гормонов, ретиноевой кислоты и PPAR базируется в основном на механизме связывания с ДНК, различия же кроются в LBD.

3. Сравнение белковых последовательностей LBD ядерных рецепторов для выявления схожих участков.

Работа белков-рецепторов базируется на высоко специфическом взаимодействии белка с молекулой-лигандом. Для этого взаимодействия необходима достаточно «твердая» пространственная структура. Поэтому биологическая функция белков тесно связана с определенностью их трехмерных структур. Знание молекулярной трехмерной структуры белка необходимо для понимания функционирования белковой молекулы.

Подавляющая часть того, что мы знаем о трехмерных белковых структурах, относится к водорастворимым глобулярным белкам. Для мембранных же и фибриллярных белков расшифрованы лишь считанные пространственные структуры или отдельные фрагменты. Причина- водорастворимые белки легче выделять в виде отдельных молекул и их структуру легче изучать методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР. К сожалению, PPAR не относятся к водорастворимым глобулярным белкам. В банке данных SwissProt последовательность PPAR-гамма расписана по вторичной структуре, однако пространственная структура неизвестна. Чтобы выйти из сложившейся ситуации нами была разработана следующая стратегия.

Мы сравнивали первичные структуры LBD PPAR с группами LBD ядерных рецепторов, выделившихся на рисунках 3 и 4. Затем мы вычеркивали консервативные позиции, полагая, что они ответственны за схожесть в механизмах действия. Нам же известно, что ни один белок из рассматриваемых нами, кроме PPAR, не способен связывать циклопентаноновые простагландины, следовательно, в участках связывания не должно быть консервативных позиций.

Рисунок 5. Фрагмент выравнивания белковых последовательностей LBD рецепторов стероидных гормонов и PPAR.

Для иллюстрации процесса рассмотрим рис. 5. Выравнивание, представленное на рис.5 выполнено в формате GeneBee, в котором консервативные позиции обозначаются знаком (*). Серым выделен столбец, содержащий единственную аминокислоту- пролин. Согласно нашей методике, мы рассматриваем эту позицию как определяющую функциональное сходство между механизмами связывания с лигандом рецепторов стероидных гормонов и PPAR. Следовательно, мы ее вычеркиваем. Конечным результатом такой работы будут являться «урезанные» белковые последовательности, представленные на рис. 6.

Рисунок 6. Результат вычеркивания консервативных позиций из белковых последовательностей рецепторов стероидных гормонов и PPAR.

На рис.6 вычеркнуты все консервативные позиции. Светло- серым обозначены позиции, содержащие родственные аминокислотные остатки. Такие столбцы мы оставляли для дальнейшей работы. При подтверждении консервативности в результате выравнивания с другим классом рецепторов мы их вычеркивали, если же такового подтверждения мы не получали, то такие позиции сохранялись.

Результатом проделанной работы явились белковые последовательности LBD PPAR изоформа альфа, бета и гамма с оставленными в них участками, не встречающимися в последовательностях LBD других ядерных рецепторов.

Рисунок 7. Фрагмент последовательностей LBD PPAR, получившихся в результате вычеркивания.

На рис. 7 приведена иллюстрация результата описанной выше работы. Светло- серым обозначены столбцы, содержавшие аминокислотные остатки с подтвердившейся консервативностью.

4. Сравнение белковых последовательностей PPAR с другими белками, связывающими циклопентаноновые простагландины. Поиск гомологов на основе результатов проделанной работы.

4.1. Сравнение белковых последовательностей PPAR с другими белками, связывающими циклопентеноновые простагландины.

Мы решили проверить результаты проделанной работы, сравнив последовательности PPAR с последовательностями других белков, про которые достоверно известно, что они связываются с циклопентаноновыми простагландинами. Для этой цели был выбран ингибитор NF-kB альфа (см. Приложение 1).

Рисунок 8. Фрагмент выравнивания белковых последовательностей ингибитора NF-kB альфа и PPAR.

На рис. 8 приведен фрагмент выравнивания последовательностей ингибитора NF-kB альфа и PPAR. Серым отмечены вычеркнутые нами позиции, эти участки мы не рассматриваем. Символом (*) обозначены консервативные позиции.

При сравнении с белком совсем другого класса и механизма действия, который имеет сходство с PPAR только в том, что способен связывать циклопентеноновые простагландины, к оставленным нами позициям, полученным при сравнении с ядерными рецепторами добавилось лишь незначительное количество уже вычеркнутых, что подтвердило наше исходное предположение. Консервативные позиции, располагающиеся в участках, не выделенных серым, и есть объекты нашего исследования. Такие позиции, определенные нами (см. п. 3), являются значимыми и могут нести биологический смысл.

4.2. Поиск гомологов на основании полученных результатов.

Дальнейшим шагом было составление паттернов на основе полученных результатов и поиск гомологов с помощью банка доменов ProSite. При составлении паттернов мы учитывали тот факт, что в процессе эволюции некоторые аминокислотные остатки могут быть заменены на функционально схожие, некоторые могут быть «вырезаны», а некоторые- добавлены. В конечном итоге мы получили следующие результаты.

Паттерн (1) был составлен для позиций 318_327 последовательности P37231 (PPAR-гамма человека). Мы даем только эту последовательность ввиду того, что выравнивание всех PPAR с вычеркнутыми позициями мы не приводим из-за его внешней неинформативности, но все результаты могут быть легко воспроизведены пытливым читателем на основании данных, которые мы приводим. Необходимо добавить, что в дальнейшем мы не будем указывать в результатах поиска последовательности PPAR-альфа, бета и гамма ввиду того, что работа велась на их основе и их появление в результатах не несет никакой смысловой нагрузки, кроме подтверждения правильности составления паттернов. Паттерн (1) выглядит следующим образом:

V-X(2)-V-X-[DE]-[LI]-T-X-[FY]

Результатом поиска по таксону Homo sapiens были последовательности:

Q07864 (DPOE_HUMAN)- ДНК-полимераза эпсилон, каталитическая субъединица А, позиции 1800_1809;

P51157 (RB28_HUMAN)- Родственный Ras белок Rab-28, позиции 89_98 во всех изоформах.

P31939 (PUR9_HUMAN)- Бифункциональный белок биосинтеза пурина, позиции 48_57.