1. Реакция связывания комплемента (РСК) – реакция Вассермана.
РСК ставится с двумя антигенами: кардиолипиновым (собственно реакция Вассермана) и трепонемным антигеном, изготовленным из непатогенных культуральных трепонем.
Сущность РСК: для связывания антигена (АГ) с антителами (АТ) – реагинами, сыворотки крови, необходим комплемент. Это соединение – АГ+АТ+комплемент – не определяется визуальным осмотром сыворотки больного. Чтобы определить, наступило ли образование этого комплекса (связан ли комплемент), применяется гемолитическая система (ГС). ГС – это эритроциты барана+гемолитическая сыворотка. Но гемолиз может произойти только при наличии комплемента.
Если в первой фазе реакции (АГ+сыворотка+комплемент) произошла реакция связывания комплемента с реагинами и кардиолипиновым антигеном, то на ГС, добавленную к первой фазе, комплемента не хватит, гемолиз не наступит, все эритроциты барана осядут на дно пробирки и испытуемая сыворотка останется бесцветной и прозрачной.
Если в испытуемой сыворотке реагинов не было, то произойдет связывание комплемента ГС – наступит гемолиз и сыворотка окрасится в красный цвет.
Оценка результатов (количественная постановка):
Резко положительная 4+ (гемолиза нет)
Положительная 3+
Слабоположительная 2+
Сомнительная 1+
Отрицательная - (наступил полный гемолиз).
Оценка результатов (количественный метод)
Еcли при обычной постановке сыворотка крови больного разводится физиологическим раствором в 5 раз, то при количественной постановке в 10, 40, 80, 160 и 320 раз. Чем больше реагинов содержится в сыворотке крови, тем больше можно развести сыворотку, чтобы она продолжала давать положительный результат.
Клиническая интерпретация результатов РСК
В первичном периоде сифилиса (С) титр реагинов постепенно нарастает и становится наивысшим вскоре после массовой гематогенной диссеминации бледных трепонем, т.е. ко вторичному свежему сифилису. В этот период титр реагинов бывает 1:160, 1:320 и даже выше. Затем титр реагинов начинает снижаться и при вторичном рецидивном С обычно не превышает 1:80. При раннем скрытом титр реагинов также невысок – 1:40 – 1:80. При позднем, третичном, С титр реагинов также бывает низким.
Под влиянием успешной терапии титр реагинов снижается и наступает негативация КСР. Если за время терапии титр реагинов снизился в 4 раза и более, то это расценивается как положительный результат терапии. Стойкое сохранение положительных КСР (серорезистентность) связано с генетически детерминированным высоким уровнем гуморального иммунного ответа, сохраняющегося и после уничтожения бледных трепонем в организме. Ложноположительные результаты – титр 1:5 – 1:20 или при качественной постановке – 2+ или 3+.
Экспресс-метод (ЭМ)
В данной реакции не нужна гемолитическая система, т.к. результат читается визуально, поскольку используется концентрированный кардиолипиновый антиген, дающий видимый осадок на планшете.
При скрытом сифилисе в спинно-мозговой жидкости не должно быть никаких патологических изменений. В противном случае речь пойдет об асимптомном нейросифилисе.
2. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)
Выявляет наличие в сыворотке крови больных сифилисом видоспецифических противотрепонемных антител. Она становится положительной через несколько месяцев после заражения и, следовательно, непригодна для диагностики первичного и вторичного свежего С. Для постановки реакции необходимо иметь постоянно стандартную взвесь живых патогенных трепонем. Еженедельно кроликам, содержащимся в виварии, прививают тканевой штамм бледных трепонем. Взвесь трепонем служит антигеном, а в сыворотке крови больных определяется наличие противотрепонемных антител, прекращающих движение возбудителей – иммобилизинов. После инкубации смеси испытуемой сыворотки крови с комплементом и взвесью бледных трепонем под микроскопом подсчитывается процент возбудителей, прекративших движение.
Результаты реакции:
РИБТ + - иммобилизация более 51% бледных трепонем
РИБТ - слабоположительная 31-50% бледных трепонем
РИБТ - сомнительная 21-30%
РИБТ – отрицательная 20% и менее.
Нельзя исследовать на РИБТ кровь больных, получающих антибиотики, поскольку последние подавляют развитие БТ. После введения бензилпенициллина кровь можно исследовать не ранее чем через 5 дней, при введении дюрантов пенициллина (бициллины), сумамеда и других медленно выводящихся из организма препаратов – не ранее 2 недель.
Показания к назначению постановки РИБТ:
1. Подозрение на поздние висцеральные и нервные формы С, а КСР - отрицательные.
2. Для подтверждения диагноза скрытого (латентного) С при положительных КСР.
3. При наличии предположения о ложноположительной реакци Вассермана.
4. Когда имеется расхождение между положительной КСР и отрицательной РИФ (реакцией иммунофлюоресценции) или наоборот (отрицательной КСР и положительной РИФ).
Преимущества и недостатки реакции: сохраняется долго (годами). Относительно быстро РИБТ негативируется только при первчном и вторичном свежем С. Стойкая негативация РИБТ – весомое доказательство излечения С.
3. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Чувствительная – становится положительной в первичной стадии даже раньше КСР, в 100% бывает положительной при вторичном и позднем нелеченом С. РИФ относится к групповым трепонемным реакциям, обнаруживающим антитела не только против бледной трепонемы, но и другим видам трепонем. Реакция РИФ-абс, при которой с помощью абсорбции групповых противотрепонемных антител РИФ становится видоспецифической, т.е. определяются антитела только к БТ. РИФ основана на непрямом методе люминесцентной серодиагностики. Для исследования употребляются меченные флюорохромом сыворотка крови кроликов, иммунизированных против глобулинов человека. Для постановки РИФ взвесь живых вирулентных бледных трепонем наносится на предметное стекло и фиксируется к нему ацетоном. Затем на это стекло наливается испытуемая сыворотка крови (или спинно-мозговая жидкость). Если в ней есть противотрепонемные антитела, то они прочно прикрепляются к БТ, фиксированным к предметному стеклу. Препарат промывается водой, избыток антител смывается, остаются лишь противотрепонемные антитела на самих БТ. Далее на это предметное стекло наносится меченная флюорохромом сыворотка против гаммаглобулинов человека. Эти антитела прикрепляются иммунными связями к противотрепонемным антителам, окутывающим БТ. После повторного промывания водой, удаляющего избыток меченных флюорохромом антител,
препарат просматривают в люминесцентном микроскопе, где видны ярко светящиеся желто-зеленоватые БТ на темном фоне.
Если в испытуемой сыворотке противотрепонемных антител нет, то налитая на предметное стекло меченная флюорохромом сыворотка будет смыта водой, а БТ не будут светиться в люминесцентном микроскопе.
Оценка реакции проводится по степени яркости свечения БТ: 4+, 3+, 2+. Поскольку титр противотрепонемных антител велик, то исследуемую сыворотку разводят физиологическим раствором в 10 раз (РИФ-10) или 200 раз (РИФ-200). РИФ-10 очень чувствительна, но дает ложноположительные результаты, РИФ-200 менее чувствительна, но число неспецифических результатов не превышает 0,3%.
РИФ-абс по чувствительности и специфичности близка к РИБТ, для ее постановки не требуется свежий антиген и реакция ставится с убитыми трепонемами.
4. Реакция гемагглютинации (АМНА-ТР-тест)
Антигеном служит взвесь бледных трепонем, содержащая 108 микробных тел в 1 мл. Эта взвесь очищается, трепонемы разрушаются ультразвуком и получается лизат, который сохраняет свои антигенные свойства в течение нескольких месяцев при комнатной температуре. Затем трепонемный лизат смешивают с отмытыми эритроцитами барана. При этом обломки бледных трепонем прочно прикрепляются к бараньим эритроцитам, образуя конъюгат. Сыворотка больного инактивируется и затем с помощью адсорбции на отмытых эритроцитах барана происходит связывание неспецифических гемагглютининов. Потом готовят ряд разведений на предметном стекле и смешивают сыворотку больного с конъюгатом. Если у больного имеется С, то в его сыворотке содержатся противотрепонемные антитела, и на предметном стекле произойдет гемагглютинация, что внешне напоминает агглютинацию при определении групп крови. Степень агглютинации можно оценить и автоматически с помощью селенового или иного фотоэлемента.
5. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Особенности серологических реакций при сифилисе у новорожденных.
1. У детей имеется врожденная недостаточность иммунной системы – первые 10 дней после рождения кровь для серологического исследования брать не рекомендуется.
2. У новорожденных могут циркулировать трансплацентарно проникшие АТ матери – причина ложноположительных реакций на сифилис у новорожденного. Разрушаются материнские антитела к 3-4 месяцу жизни ребенка.
3. В тех случаях, когда после 3-6 месяцев жизни РИБТ и РИФ остаются положительными, это значит, что в организме ребенка имеются очаги иммунного раздражения, где находятся бледные трепонемы, ребенок болен ранним врожденным С, и его организм сам вырабатывает АТ.
4. Иммуноглобулины, вырабатываемые в начальной фазе сифилитической инфекции – Ig M. Лишь позднее начинают вырабатываться Ig G. Если у матери имело место только начало сифилитической инфекции, то ее АТ, принадлежащие