6
спор B. licheniformis в 1 мл для контаминации тест-изделий из расчета 10
спор в/на тест-изделие, что достигается нанесением в/на каждое тест-изделие
0,02 мл суспензии с помощью дозатора пипеточного.
Контаминированные тест-изделия высушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 24 ч, затем их и имитаторы загрузки (пробирки и чашки Петри) упаковывают в листовую бумагу, в бумажные или полимерные пакеты, разрешенные к применению в качестве стерилизационных упаковочных материалов для воздушного метода стерилизации в Российской Федерации (пробирки - по 1 шт., чашки Петри - по 2 шт. в упаковке).
Упаковки с тест-изделиями, а также биологические индикаторы нумеруют и размещают на загрузочные полки в места размещения датчиков температуры (не менее 5 точек). Имитаторы загрузки равномерно размещают на загрузочные полки стерилизатора. Количество имитаторов загрузки, в т.ч. тест-изделий в зависимости от объема стерилизационной камеры составляет: 20 куб. дм - 40 пробирок; 40 куб. дм - 40 чашек Петри; 80 куб. дм - 80 чашек Петри; 160 куб. дм - 160 чашек Петри; 320 куб. дм - 320 чашек Петри; 640 куб. дм - 640 чашек Петри.
Стерилизатор включают и после достижения номинального значения температуры стерилизации начинают отсчет времени стерилизационной выдержки. По окончании времени стерилизационной выдержки тест-изделия и биологические индикаторы вынимают из стерилизатора. Пробирки заливают питательным бульоном (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ); чашки Петри - питательным агаром (агар Хоттингера, МПА, СПА).
Инкубирование тест-изделий проводят при температуре (37 +/- 1) °С в течение 21 сут. при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ); чашки Петри инкубируют в течение 7 сут. Учет результатов проводят путем визуального осмотра.
Отсутствие помутнения питательного бульона, роста микроорганизмов на чашке Петри указывает на гибель спор в/на тест-изделиях. При наличии роста микроорганизмов проводят сравнение выделенной культуры с тест-микроорганизмом.
В качестве средств контроля используют тест-изделия, которые не подвергают обработке в стерилизаторе. Посевы контрольных тест-изделий или смывы с них в питательную среду, а также инкубирование посевов осуществляются аналогично тест-изделиям, которые подвергали обработке в стерилизаторе.
Аналогичную методологию исследования применяют при отработке эффективных режимов стерилизации ИМН в стерилизаторах разных марок, в т.ч. во вновь разрабатываемых стерилизаторах. Для этого эксперименты проводят при различном времени выдержки и размещении тест-объектов и тест-изделий, датчиков температуры в различных точках стерилизационной камеры. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки.
Критерием эффективности сухого горячего воздуха для стерилизации ИМН является 100%-ная гибель спор B. licheniformis на обработанных в исследуемом аппарате тест-объектах и тест-изделиях из различных материалов.
8.3. Исследования спороцидной эффективности растворов
химических СС, предназначенных для стерилизации ИМН
Культивирование спорообразующих тест-микроорганизмов, устойчивых к действующему веществу, входящему в состав изучаемого СС, приготовление суспензии спор, а также хранение контаминированных тест-изделий осуществляют согласно изложенному в п. п. 3.1 - 3.4.2. В качестве тест-носителей используют простерилизованные тест-образцы из различных материалов (пластмасс, резин на основе натурального и силиконового каучука, стекла, металлов), имитирующие ИМН, а также сами ИМН (катетеры, боры и зеркала стоматологические, зажимы, эндоскопы). Для контаминации тест-носителей используют споры тест-микроорганизма, обладающего наибольшей устойчивостью к раствору данного химического агента.
При испытании раствора средства на основе ранее не изучавшегося для этой цели действующего вещества подбирают устойчивый спорообразующий микроорганизм, споры которого могут быть использованы в качестве тест-микроорганизма (п. 3.1).
С целью контаминации тест-изделий на них капельным способом наносят
6
суспензию спор тест-микроорганизма (из расчета 10 микробных клеток в
споровой форме на тест-изделие). Тест-микроорганизмы должны быть нанесены
на наиболее сложные по конструкции и труднодоступные участки тест-изделий:
в каналы, рабочие и замковые части. После этого тест-изделия подсушивают в
течение 60 мин. при температуре (37 +/- 1) °С.
При проведении экспериментов изделия погружают в рабочие растворы таким образом, чтобы раствор полностью покрыл изделия (толщина слоя раствора над поверхностью изделий должна быть не менее 1 см) и заполнил все полости и каналы без воздушных пробок. Инструментами, имеющими замковые части, необходимо сделать несколько рабочих движений для лучшего проникновения раствора средства в области замка. При исследованиях используют растворы, имеющие комнатную температуру (18 - 20) °С. При испытании растворов альдегидсодержащих средств температура раствора должна составлять (20 - 22) °С. В случае необходимости (для повышения активности растворов) готовят рабочие растворы умеренно-повышенной температуры (50 +/- 1) °С. Одновременно не менее чем по два тест-объекта помещают в воду, а также в раствор нейтрализатора на время, соответствующее максимальному исследуемому времени выдержки в изучаемом растворе средства.
Изучение эффективности средства и его рабочих растворов в зависимости от сроков хранения, а также (при необходимости) изучение эффективности рабочих растворов при многократном их использовании осуществляют аналогично указанному выше, применяя растворы средства с различными сроками хранения и кратностью использования для стерилизации.
При работе с тест-объектами и изделиями небольшого размера (боры) через определенные интервалы времени (в зависимости от состава средства) изделия извлекают из раствора исследуемого средства и последовательно осуществляют отмыв в растворе нейтрализатора и стерилизованной питьевой воде (по 5 мин.) с последующим прямым посевом на жидкие питательные среды с 0,5% глюкозы.
При работе с крупными изделиями для контроля стерильности подвергнутых обработке средством изделий осуществляют посев марлевых салфеток (размер 5 х 5 см), с помощью которых производят отбор проб с изделий методом смыва. Салфетки предварительно увлажняют раствором соответствующего нейтрализатора. При отмыве изделий, имеющих каналы, через последние пропускают раствор нейтрализатора. Если нейтрализатор для изучаемого средства не известен, целесообразно использовать универсальный нейтрализатор, проверенный на эффективность. Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 14 сут.
Критерием эффективности является достижение 100%-ной гибели спор тест-микроорганизма на всех тест-изделиях. При этом время действия раствора должно составлять не более 16 ч при температуре (18 - 20) °С и не более 3 ч при умеренно повышенной температуре (50 °С).
9. Метод исследования и оценки спороцидной
эффективности СС, предназначенных для ДВУ эндоскопов
Средства, предназначенные для ДВУ эндоскопов, должны обеспечивать гибель на эндоскопах споровых форм микроорганизмов.
При изучении в качестве тест-объектов используют простерилизованные фрагменты канала гибкого эндоскопа в виде пластмассовых трубок длиной 20 мм и внутренним диаметром 2 мм. Перед проведением эксперимента тест-объекты подвергают очистке одним из средств, разрешенных для предстерилизационной очистки эндоскопов, а затем стерилизуют физическим (паровым) или химическим методом, рекомендованным для стерилизации гибких эндоскопов.
Простерилизованные тест-объекты искусственно контаминируют, нанося с
помощью дозатора/микропипетки в центральную часть канала и на поверхности
6
каждой трубки суспензию спор тест-микроорганизма (п. 3.1) из расчета 10
спор на каждый тест-объект. Контаминированные тест-объекты подсушивают при
температуре (37 +/- 1) °С в течение 120 мин.
Обработку исследуемым средством осуществляют способом погружения в исследуемый раствор, имеющий температуру (18 - 20) °С (для альдегидсодержащих средств - (20 - 22) °С). При проведении экспериментов тест-изделия погружают в рабочие растворы таким образом, чтобы раствор полностью покрыл изделия (толщина слоя раствора над поверхностью изделий должна быть не менее 1 см) и заполнил все полости и каналы без воздушных пробок. Через определенные интервалы времени, зависящие от химического состава средства (от 5 до 30 мин.), тест-изделия извлекают из раствора и помещают на 5 мин. в раствор соответствующего нейтрализатора, проверенного на эффективность. После этого тест-изделия переносят в пробирки с жидкой питательной средой (СПБ) с 0,5% глюкозы. Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 21 сут. Предварительный учет результатов осуществляют через 48 - 72 ч, а окончательный - на 21 сут. В качестве контроля используют тест-объекты, контаминированные, как указано выше, и помещенные в нейтрализатор и в водопроводную воду на время максимальной стерилизационной выдержки.
Эффективным считают режим (концентрация - время - температура), обеспечивающий 100%-ную гибель спор тест-микроорганизма на всех тест-объектах при отсутствии его в нейтрализаторе. При наличии положительных проб эксперимент повторяют, увеличивая время воздействия, но не более чем до 16 ч. Режим стерилизации, разработанный на имитаторах канала эндоскопа, проверяют при обработке эндоскопа, контаминированного тест-микроорганизмом.
Критерием эффективности является достижение 100%-ной гибели спор тест-микроорганизма на всех тест-изделиях. При этом время действия раствора должно составлять не более 16 ч при температуре (18 - 20) °С и не более 3 ч при умеренно повышенной температуре (50 +/- 1) °С.
10. Оценка результатов исследования спороцидной активности