3.4. Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза. | 3.4. Laboratory methods of mycobacterium tuberculosis diagnosis. |
В будущем не трудно будет решить, что это - туберкулез или нет … Демонстрация туберкулезной бациллы… решит вопрос | In the future it will not be difficult to decide what tuberculosis is and what is not… The demonstration of tubercle bacilli… will settle the question Robert Koch |
Лабораторная диагностика обеспечивает выполнение главной задачи диагностики и лечения туберкулеза – выявление у больного МБТ. В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики: | Laboratories serve major roles in the diagnosis and management of tuberculosis – to reveal MBT at a patient. The laboratory MBT identification consists of the following methods: 1. sputum collection and processing; 2. microscopic identification of MBT in secretions or tissues; 3. cultivation techniques; 4. drug susceptibility testing; 5. serological testing; 6. performance of novel molecular biological methods of MBT identification, including polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). |
Сбор мокроты, содержащую МБТ, проводится в специально подготовленном помещении больницы или в амбулаторных условиях. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. | Collection of sputum specimens with MBT could be made in special medical institutions and in various types of outpatient clinics. The collected specimens should immediately be sent to the laboratory for examination. |
Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого. | Special sputum containers should be used. They must be rigid to avoid crushing in transit and possess a wide-mouthed screw top hermetically scalable cover to prevent desiccation and to minimize contamination by leakage. |
Имеются два удобных для этого типа контейнеров. Один – распространяемый международной организацией UNICEF (ДЕТСКИЙ ФОНД ООН), является пластмассовой пробиркой с черным основанием, прозрачной крышкой, утилизация которого может быть обеспечена сжиганием. На контейнере (не на крышке) отмечаются данные обследуемого. Другой тип контейнера – сделан из прочного стекла, с завинчивающейся крышкой. Такой контейнер может многократно использоваться после дезинфекции, кипячением (10 мин.) и c полной очисткой. | There are two acceptable types of container. One available from UNICEF (UN Children’s fund), is plastic with a black bottom, a translucent lid, and is readily destroyed by burning; the patient's identification must be made on the container (not on the lid). The other is a heavy glass, screw-capped jar that may be re-used after disinfections by boiling (10 min.) and thorough cleaning. |
При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении. | There is a very high risk of infection when the patient coughs, therefore specimens should be collected as far away as possible from other people in specially prepared room. |
Дополнительные процедуры для сбора МБТ. | Additional procedures for MBT collection. |
Забор образцов из гортани тампоном. У пациентов, не имеющих мокроту, для получения материала для посева МБТ можно использовать тампоны на палочке. Оператор должен носить маску и закрытый халат: язык пациента вытягивается изо рта, одновременно тампон вводится, за языковое пространство ближе к гортани. Во время кашля пациента можно собрать часть слизи. Тампон помещается в закрытый сосуд и направляется в бактериологическую лабораторию. | Laryngeal swabs. The operator should wear a mask and gown when taking a swab: the patient's tongue is held using a piece of lint and the swab pushed down behind the tongue towards the larynx. The patient will cough and the swab will catch some mucus. Put the swab back into the sterile bottle and send to the laboratory for culture. |
| Промывные воды бронхов. Для своевременной диагностики туберкулеза легких и и трахеобронхиальной системы большое значение имеет раннее распознавание поражения бронхов. Для этой цели в практике применяется исследование промывных вод бронхов. Методика получения промывных вод не сложна, но надо помнить о противопоказаниях ее применения. Людям старческого возраста промывание бронхов следует делать, с большой осторожностью. Процедура противопоказана при заболеваниях бронхиальной астмой, а также при явлениях сердечно-легочной недостаточности. | Bronchial flush waters. For good time diagnostics of lung tuberculosis and tracheal and bronchial systems the large importance has early recognition of the bronchi defeat. The bronchi flush waters examinations are applied in practice for this purpose. The technique of bronchi flush waters is not difficult, but it is necessary to remember contra-indications of its application. This technique should be applied with large care to the people of senile age. The procedure is contra-indicated at bronchial asthma, and also at the signs of heart-lung insufficiency. |
| Для получения промывных вод бронхов больному анестезируют дыхательные пути. Гортанным шприцем вводят 15—20 мл физиологического раствора, подогретого до 37°. Это усиливает секрецию слизистой бронхов. Откашливая, больной выделяет промывные воды. Их собирают в стерильную посуду и обрабатывают обычным способом для бактериоскопии и посева на средах для выращивания БК. Производится исследование отдельного бронха или целого ветвления. Метод бактериоскопии промывных вод, и особенно их посев, увеличил число находок БК на 11—20%. | For reception of bronchial flush waters first anesthesia is carried out of patient’s upper respiratory ways. With the help of the larynx syringe the 15-20 ml of a physiological solution, are released into, warmed up to 37 C. It strengthens secretion of bronchial mucosal expectorations. The patient coughing out expectorates flush waters. The waters are collected to sterile flasks and are processed by the usual way for bacterioscopy or for MBT cultivation. The examinations could be made in separate bronchus or for the whole branch. The method of bacterioscopy of bronchial flash waters and especially their cultivation on media has increased number of MBT reveals on 11-20 %. |
Промывные воды желудка. Промывные воды желудка нередко исследуются у детей, которые не умеют откашлять мокроту, а также у взрослых при скудном количестве мокроты. Метод не труден и дает довольно большой процент обнаружения БК в промывных водах желудка или бронхов у больных не только легочным туберкулезом, но и туберкулезом других органов (кожи, костей и суставов и др.). | Gastric suction (Gastric flush waters). Gastric suction usually used among children who are not able to cough out sputum, and also at those adults, which have poor amount of sputum. The method is not difficult and gives rather high percent of detection MBT not only with lung tuberculosis, but also with tuberculosis of other organs (skin, bones, joints etc.). For reception of gastric flush waters the patient in the morning should have to drink a glass of water. Then through gastric tube collect waters from the stomach in sterile flasks. After that, water is centrifuged, and then smear is produced from purulent elements of the received precipitate and is stained by a usual way, as the sputum. |
| Исследование спинномозговой жидкости. При подозрении на туберкулезный менингит необходимо в первые дни сделать анализ спинномозговой жидкости. При взятии спинномозговой жидкости обращается внимание на степень давления, под которым она вытекает из спиномозгового канала. Жидкость, вытекающая непрерывной струей под большим давлением, свидетельствует о повышенном внутричерепном давлении. Жидкость, выделяющаяся крупными частыми каплями, говорит о нормальном давлении, а редкими малыми каплями — о пониженном давлении или о препятствии для истечения ее. Материал для исследования берут в две стерильные пробирки. Одну оставляют на холоде и через 12—24 часа, в ней образуется нежная паутинообразная пленка. Из другой пробирки берут ликвор для биохимических исследований и изучения цитограммы. | Examination of cerebrospinal fluid. At suspicion of tubercular meningitis it is necessary at the first days to make the analysis of cerebrospinal fluid. When the cerebrospinal fluid is obtained, attention should be paid to a degree of pressure, under which it is discharged from the channel. The liquid flowing by a continuous jet under the large pressure, testifies about increased intracranial pressure. If the liquid expectorates by large often drops, it is a sign of normal pressure, and rare small drops - about the lowered pressure or about of the obstacles of it discharges. Material for research is placed in two sterile tubes. One tube is left in the cold and after 12-24 hours the film is formed on the surface of the liquor. From another tube the liquor is send for biochemical and cytological examinations. |
Бронхоскопия. Когда другие методы не сумели обеспечить постановку диагноза, применятся сбор материала непосредственно из бронхов, через бронхоскоп. Биопсия выстилающих бронхи тканей может иногда содержать типичные для туберкулеза изменения, с последующим гистологическим исследованием. | Bronchoscopy. When other methods have failed to make a diagnosis it is possible to collect bronchial material by a trap specimen through a bronchoscope. Biopsy of the lining of the bronchi may sometimes show typical changes of tuberculosis when hystologicaly examined. |
Плевральная жидкость. В плевральной жидкости МБТ могут быть выявлены с помощью флотации, но обычно обнаруживаются только в культуре. Чем большее количество жидкости используется для культурального исследования, тем вероятней положительный результат. | Pleural fluid. MBT may occasionally be seen in centrifuged pleural fluid, but usually are only found on culture. The larger the amount of fluid cultured the more likely it is that you will get a positive result. |
Биопсия плевры. Биопсия плевры может быть полезна, в тех случаях, когда имеется ее поражение. При этом необходима специальная биопсийная игла, средства для проведения гистологического исследования и обученный персонал | Pleural biopsy. Pleural biopsy can be useful when there is pleural effusion. But it needs a special biopsy needle (Abrams punch), facilities for histology and training in the technique. |
Биопсия легкого. Биопсия легкого должна выполняться хирургом, в стационарных условиях. Диагноз может быть сделан на основе гистологического исследования или обнаружения МБТ в секционном материале. | Lung biopsy. Only experienced surgeons should use this method. A diagnosis may be made by histology or by finding ТВ in the sections. |
Микроскопия мокроты. | Sputum microscopy. |
| Уже более 100 лет существует самый простой и быстрый метод выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) - это микроскопия мазка. КУБ – микобактерии способные оставаться окрашенными даже после обработки кислотными растворами и могут быть выявлены с помощью микроскопа в окрашенных образцах мокроты. Микобактерии отличаются от других микроорганизмов характерным составом своей клеточной стенки, состоящей из миколовых кислот, которые, благодаря своим сорбционным свойствам, обеспечивают способность окрашиваться по методикам, выявляющим КУБ. | For more than 100 years exists the most simple and fast method of revealing acid fast bacilli (AFB) is sputum microscopy. AFB –mycobacteria that stay stained even after they have been washed in an acid solution and may be detected under a microscope in a stained smear. Mycobacterium differs from other microorganisms by characteristic structure of their cell wall consisting from mycolic acids, which, due to sorption properties, cause ability to be painted on techniques revealing an AFB. |
| Резистентность к стандартным методам окрашивания и способность МБТ сохранять раннее окрашивание, является следствием высокого содержания липидов во внешней оболочке клетки. Вообще, грамм-положительные бактерии, в своем составе, имеют приблизительно 5 % липидов или воска, грамм-отрицательные организмы около - 20 % и МБТ примерно 60 %. | This resistance to standard dyes and the avidity with which the mycobacterium retain certain dyes, once impregnated, are both due to the high lipid content of their cell walls. Generally, gram-positive bacteria have about 5% lipid or wax content in their cell walls, gram-negative organisms around 20%, and the mycobacterium roughly 60%. |
| Бактериоскопия мокроты или другого отделяемого проводится «простым» методом и методом флотации. При простом методе мазки приготавливают из комочков мокроты или капель жидкого вещества (экссудата, промывных вод и др.). Материал помещают между двумя предметными стеклами. Один из мазков окрашивают по Грамму на общую флору, другой — на туберкулезные микобактерии. | Sputum mycroscopy or other separated material with MBT is carried out by a "simple" method and method of flotation. In simple method, smear is prepared from sputum lumps or drops from liquid substance (exudates, flash waters etc.). A material is placed between two subject glasses. One of smears is processed be Gram’s stain, for revealing common flora, another – for MTB reveal. |
| Метод, который до сих пор используются это карбол-фуксиновый (метод Циля-Нильсена). Основной принцип этого метода состоит в способности наружной оболочки МБТ адсорбировать карбол-фукцин. Поглощая красный карбол-фуксин, наружная мембрана МТБ настолько прочно абсорбирует краску, что ее нельзя удалить обработкой серной кислотой или соляно кислым спиртом. Затем образец обрабатывается метиленовым синим. При эмерсионной микроскопии МБТ появляются в виде красных палочек на синем фоне. | Techniques that are still employed today—the carbol-fuchsin methods of Ziehl-Nielsen. The fundamental principles of these methods relate to the ability of the cell wall to absorb carbol-fuchsin dye. The mycobacterial cell walls absorbing the red carbol-fuchsin are becoming so impregnated, that they resist decolorization even with a potent hydrochloric acid-ethanol solution (acid-alcohol). So, when the slide is counterstained with methylene blue, the mycobacterium appears as a red rod on the blue background. |
| Начиная с 1989 в современных лабораториях флюоресцентная микроскопия в значительной степени вытеснила старые методы, основанные на кислотоустойчивости микобактерий. Этот метод основан на тех же свойствах МБТ, связанные со способностью наружной мембраны МБТ, богатой липидами, удерживать соответствующий краситель в этом случае – аурамин-родамин. МБТ поглощая это вещество, одновременно устойчива обесцвечиванию соляно-кислым спиртом. При этом, МБТ, окрашенные аурамин-родамином, флюоресцируют под воздействием ультрафиолета или другими световыми спектрами света, выделенными соответствующими фльтрами. При этом МБТ проявляются как ярко-желтые палочки на черном фоне. | Since 1989, fluorescence microscopy has largely supplanted the older, acid-fast methods in modern laboratories. Fundamentally, this technology relies on the same lipid-related avidity for dyes, but the stain in this case is auramine-rhodamine. The mycobacteria absorb this agent and resist decolorization with acid-alcohol; however, the auramine-rhodamine-stained bacilli fluoresce when excited with UV or other specially filtered light frequencies. The mycobacteria appear as bright yellow rods against an inky black background in the UV system. |
| Подготовка образца для культурального исследования. | Preparation of the sputum for cultural examination. |
При поступлении в современную лабораторию диагностического материала, с возможным содержанием МБТ, проводятся следующие диагностические манипуляции. | When diagnostic material with the probable MBT contents is accepted in modern microbiological laboratory the following diagnostic manipulations will be carried out. 1. Mycolytic acids (MAC) are added to disperse protein substances. 2. A sample decontamination to eliminate the normal respiratory flora. 3. Shaking of the mixture and to stand for precipitation. 4. Centrifugation in a refrigerator. 5. Pellet containing most of the bacilli collects in apex of tube used for microscopy and culture plating inoculation 5.1. Lowenstein-Jensen inspissated egg; 5.2. 7-11 Selective agar; 5.3. Automated liquid culture systems (MB/BacT или BACTEC MGIT 960). |
Молекулярно-генетические методы диагностики МБТ. | MBT molecular-genetic diagnostic methods. |
| Расшифровка генома МБТ открыла неограниченные перспективы, в разработке генетико-молекулярных тестов, в том числе в изучении и выявлении МБТ и ее диагностике в организме человека. | Deciphered MBT genome has opened unlimited prospects, in development of the genetic-molecular tests, including in study and revealing MBT and its diagnostics in the host. |
Классические методы, применяемые для обнаружения наличия в организме микобактерий туберкулеза, такие как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления МВТ. Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобактерий в клинических образцах. | The classical methods used for detection of MBT presence in host, such as bacterioscopy, cultural, serological, cytological are rather effective, but differ either insufficient sensitivity, or duration of revealing МВТ. Development and the perfection of molecular-diagnostic methods has opened new prospects for fast revealing MBT in clinical samples. |
| Наибольшее распространение получили метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции основан на амплификации особых фрагментов бацилярной ДНК, которая обнаруживается в диагностических образцах. Тест предназначен для выявления МБТ в мокроте или для идентификации разновидности бактерий, которые произрастают в культуральной среде. | Polymerase Chain Reaction шы mostly used (PCR). |
| Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МВТ в диагностическом материале за 5-6 часов (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце). | The PCR allows to carry out MBT identification in a diagnostic material for 5-6 hours (including processing of a material) and has high specificity and sensitivity (in a range from 1-10 of cells in a sample). |
3. Методы диагностики туберкулеза. The methods of tuberculosis diagnostics.