Тема: введение в биохимию (стр. 2 из 8)
4. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д. Биологическая химия. – Минск: Асар, 2008. – С. 39-44.
5. Конспект лекций.
ЗАНЯТИЕ № 5
ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ – Ι
ЦЕЛЬ: Сформировать знания о природе, свойствах и механизмах действия ферментов. Отработать методические подходы к определению активности и изучению свойств ферментов.
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:
1. Разбор вопросов теоретического раздела.
2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:
2.1. Химическая природа ферментов, представление об активном центре.
2.2. Особенности ферментативного катализа и этапы ферментативной реакции.
2.3. Методы определения ферментативной активности:
по измерению концентраций (количеств): субстрата, продукта, формы кофермента
по способу измерения концентрации: прямое измерение спектральных характеристик, рН, химическими и физико-химическими методами, с помощью сопряженных реакций, с помощью радиоактивных изотопов.
2.4. Реакция, катализируемая амилазой. Принцип метода определения активности фермента.
2.5. Факторы, влияющие на активность амилазы (температура, активаторы, ингибиторы).
2.6. Принципы методов определения активности диастазы (амилазы) мочи по Вольгемуту, мочи и крови по Каравею. Единицы амилазной активности.
2.7. Диагностическое значение определения активности диастазы мочи.
3. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
3.1. Влияние температуры на активность амилазы.
3.2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.
3.3. Определение активности амилазы (диастазы) мочи по Каравею.
4. Контроль выполнения лабораторной работы.
5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. – М.: Высш. шк., 1988.- С. 60-61, 79-80. Работы 31 и 45.
2. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1983. С. 64-66.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ
1. История открытия и изучения ферментов.
2. Химическая природа ферментов. Активный и аллостерический центры.
3. Кофакторы ферментов: ионы металлов, коферменты. Коферментные функции витаминов.
4. Механизмы действия ферментов.
5. Молекулярные механизмы ферментативного катализа (кислотно-основной, ковалентный, электростатический)
6. Особенности ферментативного катализа. Специфичность действия ферментов.
7. Классификация и номенклатура ферментов.
8. Изоферменты.
9. Единицы измерения активности и количества фермента.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 114-134, 142-143, 157-158, 159-163.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 92-108, 114-115, 124-125, 126-129.
3. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 53-58, , 61-73, 76-77, 81-83, 89-90.
4. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д. Биологическая химия. – Минск: Асар, 2008. – С. 45-49, 53-56, 58-60, 66-69, 76, 79-80, 81-82.
5. Конспект лекций.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) МОЧИ ПО ВОЛЬГЕМУТУ
Принцип метода: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, сыворотка крови, слюна) основано на нахождении наименьшего количества фермента, необходимого для полного расщепления добавленного крахмала в стандартных условиях.
Амилазная активность мочи выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 450С за 15 минут.
В норме моча человека содержит мало амилазы, происходящей из поджелудочной железы. Активность амилазы (диастазы) мочи обозначается А450 (или d450). В норме активность амилазы мочи равна 16-64 ед.
Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинической практике с целью диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.
В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эпидемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.
Ход работы: Берут 10 пронумерованных пробирок, приливают в каждую по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во 2-ю пробирку и т.д. до 10-й пробирки. Из 10-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, по 2 мл 0,1% раствора крахмала и, перемешав, все пробирки помещают в термостат на 15 мин. при 45оС. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят по порядку в штатив. Прибавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала (желтая окраска с йодом). Полученные данные заносят в таблицу.
| № пробирки | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Разведение мочи | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | 1:1024 |
| Гидролиз крахмала (полный, частичный, отсутствует) | ||||||||||
| Окраска с йодом |
Расчёт: Предположим, что полное расщепление крахмала произошло в первых четырёх пробирках. В четвёртой пробирке разведение мочи 1:16. Следовательно: 1/16 мл мочи расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала, 1 мл неразведенной мочи расщепит Х мл 0,1% раствора крахмала
2 · 1 · 16
X = -------------- = 32 мл 0,1 % раствора крахмала.
1
Следовательно, активность амилазы (диастазы) мочи равна 32 ед.
ЗАНЯТИЕ № 6
ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ – ΙΙ
ЦЕЛЬ: Сформировать знания о регуляции ферментативной активности. Изучить действие липазы и влияние желчи на активность фермента.
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:
1. Разбор вопросов теоретического раздела.
2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:
2.1. Реакция, катализируемая липазой, ее роль в процессе пищеварения.
2.2. Факторы, активирующие липазу в кишечнике.
2.3. Изменение скорости ферментативной реакции во времени.
2.4. Принцип метода количественного определения активности липазы.
2.5. Принцип метода определения активности щелочной фосфатазы.
3. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
3.1. Кинетика действия липазы. Влияние желчи на активность липазы.
4. Контроль выполнения лабораторной работы.
5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1988. - С. 146-148. Работа 82.
2. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983. – С. 72.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ
1. Кинетика ферментативных реакций, анализ и графическое изображение уравнений Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка.
2. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН, концентраций субстрата и фермента.
3. Ингибиторы и активаторы ферментов. Типы ингибирования: обратимое (конкурентное и неконкурентное), необратимое.
4. Аллостерические ферменты. Аллостерические эффекторы.
5. Лекарственные препараты-ингибиторы ферментов.
6. Механизмы регуляции ферментативной активности.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 134-142, 143-157.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 108-114, 115-124.
3. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 73-76, 78-81, 84-89.
4. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д. Биологическая химия. – Минск: Асар, 2008. – С. 51-53, 57-58, 60-64, 70-79, 81.
5. Конспект лекций.
ЗАНЯТИЕ № 7
ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ – III
ЦЕЛЬ: Сформировать знания о клинических аспектах энзимологии и закрепить знания о структуре и функциях белков и ферментов.
СЕМИНАРСКОЕ ЗАНЯТИЕ
СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:
1. Разбор вопросов теоретического раздела.
2. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.
3. Самостоятельная аудиторная работа в соответствии с предложенными заданиями.
4. Решение и обсуждение ситуационных задач.
5. Контроль выполнения самостоятельной работы.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ
1. Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты.
2. Определение ферментов в плазме крови с диагностической целью: причины ферментемии, происхождение ферментов плазмы крови.
3. Изменение активности ферментов при патологии. Наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные) энзимопатии.
4. Использование данных кинетических исследований ферментов в диагностике.
5. Применение ферментов для лечения болезней и как аналитических реагентов в лабораторной диагностике. Иммобилизованные ферменты.