Таблица 6
Определение наночастиц в ультратонких срезах клеток, тканей и органов животных и растений методами просвечивающей электронной микроскопии
| Детекция наночастиц в срезах клеток, тканей и органов животных и растительных макроорганизмов | Согласно п.6.3. |
| Идентификация наночастиц металлов и оксидов металлов в срезах клеток, тканей и органов животных и растительных макроорганизмов | – выбирают область образца, которая содержит типичные структуры, обладающие морфологическими признаками техногенных наночастиц (электронная плотность, форм-фактор); – с выбранной области получают картину дифракции электронов. Наличие характеристичной картины дифракции является указанием на кристаллическую структуру (подтверждением кристаллической структуры) идентифицируемых наночастиц. Отсутствие дифракционных максимумов свидетельствует от аморфной структуре анализируемых наночастиц; – дополнительно к измерению дифракционной картины измеряют спектр ХПЭЭ, позволяющий установить или подтвердить элементный состав анализируемых наночастиц; – если анализируемые наночастицы обладают интенсивным спектром ХПЭЭ, рекомендуется их идентификацию и анализ распределения проводить с применением метода элементного картирования. Это позволяет исключить ошибочное отнесение эндогенных наночастиц к анализируемым техногенным наночастицам. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений срезов клеток, тканей и органов животных и растительных макроорганизмов | – оценивают морфологические характеристики наночастиц в образце: размер, форм-фактор, распределение по размерам и степень полиморфизма – оценивают характер наколпения наночастиц: в виде отдельных наночастиц или с тенденцией к агрегированию разной степени; – оценивают объемную концентрацию наночастиц в образце; Примечание – Для приблизительной оценки объемной концентрации наночастиц вычисляют среднюю плотность наночастиц в срезе σ = Σ Ni/ Σ Si, где Ni – количество наночастиц в поле i, Si – площадь поля i. Объемную концентрацию оценивают по формуле γ = σ3/2. – устанавливают наличие и оценивают характер и степень структурно-морфологических изменений в клетках; – устанавливают внутриклеточную локализацию обнаруженных наночастиц |
6.4.5. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в воде природных и искусственных водоёмов
К природным и искусственным водоёмам относятся родники, колодца, озера, реки, водохранилища, которые служат источниками питьевой и технической воды для человека. В природные и искусственные водоемы, расположенные вблизи крупных городов и промышленных предприятий, различными путями могут попасть наноматериалы, опасные для человека и окружающей среды.
Целью является определение наличия наночастиц в воде природных и искусственных водоемов, проведение структурной и морфометрической идентификации частиц в воде.
Для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в воде природных и искусственных водоёмах из водоема с различной глубины водоема (0,1 м; 1 м; 2 м; 3 м и т. д.) пробоотборником отбирают по 1-2 л воды. Каждую пробу воды выливают в химически чистую круглодонную колбу со шлифом вместимостью 2-3 л. Колбу с водой, соединенную с водоструйным или роторным вакуумным насосом, помещают на водяную баню и при температуре 80-90 ºС выпаривают воду до объема 1-10 см3.
На пять электронно-микроскопических медных сеточек, покрытых формваровой или коллодиевой пленкой, наносят по одной капле воды (50-100 мм3), через 1 мин удаляют всю жидкость с поверхности сеточки и окрашивают 1,0 % раствором уранилацетата.
Просмотр сеточек с исследуемым материалом проводят в просвечивающем электронном микроскопе при увеличениях 20000-100000 крат и ускоряющем напряжении 75 кВ.
В электронном микроскопе с каждой сеточки, при оптимальном разрешении фотографируют или снимают на электронном носителе 10 полей изображения исследуемого объекта, на котором присутствуют структурные элементы исследуемого образца.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в воде природных и искусственных водоемов представлена в таблице 7.
Таблица 7
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в воде природных и искусственных водоемов
| Объект исследования | Вода природных и искусственных водоемов |
| Физическая форма объекта исследования | Жидкость (вода питьевая или вода техническая для коммунальных и хозяйственных нужд человека) |
| Количество материала для выполнения исследований | 1-2 см3 воды, полученной после медленного выпаривания 1-2 дм3 воды |
| Приборное обеспечение | Пробоотборник воды, роторный вакуумный насос или водоструйный насос, водяная баня, просвечивающий электронный микроскоп по п.6.1.1. |
| Материалы | Круглодонные колбы вместимостью 2 или 3 л со шлифом, пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1 (подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата. Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – пробы воды из водоема в химически чистых колбах, соединенных с роторным вакуумным насосом или с водоструйным насосом, выпаривают на водяной бане при температуре 80-90 ºС до уменьшения первоначального объема воды в 1000-2000 раз. – пробы воды наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой (коллодиевой) пленкой; – при необходимости сеточки контрастируют 1,0 % раствором уранилацетата |
| Исследование проб воды в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п. 6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений Наночастиц в пробах воды | Основные этапы: – визуализация наночастиц в структуре образца; – морфометрический анализ наночастиц; – определение степени полиморфизма наночастиц в воде; –определение степени агрегированности наночастиц в воде |
| Основные параметры и характеристики наноматериала в воде для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в образце; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – структура рельефа поверхности частиц; – степень полиморфизма наночастиц в воде; – степень агрегированности наночастиц в воде |
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в пробах воды природного или искусственного водоема содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемых пробах воды, данные о степени агрегированности наночастиц, электронно-микроскопические изображения наночастиц в воде.