Пробоподготовка тканей животных и растений для проведения электронно-микроскопических исследований может выполняться без контрастирования или с применением контрастирующих агентов (таблицы 4,5).
Препарирование без контрастирования можно использовать, если определяемые наночастицы обладают более высокой электронной плотностью (ВЭП-наночастицы), чем биологический материал (матрикс), в котором их требуется обнаружить и охарактеризовать. Препарирование без контрастирования является наилучшей и наиболее простой методикой для электронно-микроскопических исследований ВЭП-наночастиц в рамках задач (1)-(5), но оно не подходит для решения задач (6)-(8).
Если определяемые наночастицы обладают электронной плотностью сравнимой с электронной плотностью биологического материала, в котором их требуется выявлять (наночастицы с низкой электронной плотностью, НЭП-наночастицы), то препарирование следует выполнять с применением контрастирующих агентов. При этом для электронно-микроскопических исследований НЭП-наночастиц в рамках задач (1)-(5) необходимо подобрать те контрастирующие агенты и процедуры их использования, которые обеспечивают наилучшее распознавание определяемых наночастиц в биологическом материале.
Препарирование с применением контрастирующих агентов следует использовать для любых наночастиц при электронно-микроскопических исследованиях в рамках задач (6)-(8). При решении задач (6) и (7) применение агентов, делающих клеточные и тканевые структуры более контрастными и узнаваемыми, не должно мешать распознаванию наночастиц в этих структурах. При решении задачи (8) контрастирующие агенты и процедуры их применения выбираются так, чтобы обеспечить наиболее достоверный анализ наличия, характера и степени морфологических изменений в клеточных и тканевых структурах пусть даже и в ущерб возможности распознавания наночастиц в этих структурах. Все процедуры пробоподготовки проводятся только в стеклянной посуде.
Таблица 4.
Подготовка образцов для определения наночастиц методами ПЭМ в тканях животных
| Вид исследуемого материала | фрагменты тканей и органов животных |
| Физическая форма исследуемого материала | изолированные кусочки тканей и органов животных, фиксированные в 2,5 % глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,2-7,4 с добавлением 2% нейтрального формалина |
| Количество материала для выполнения исследований | по 4 кусочка каждого вида образцов (из одного органа или гистологически выделяемого типа ткани) |
| Приборное обеспечение | Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4. |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой, автоматические пипетки вместимостью 1 см3 и 200 мм3, наконечники к автоматическим пипеткам, пипетки вместимостью 5 см3, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пенициллиновые флаконы вместимостью 10 см3, мерный цилиндр вместимостью 100 см3, стеклянные или алмазные ножи для ультрамикротома |
| Химические реактивы | хлорид натрия, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, четырехокись осмия (OsO4), 96 % этиловый спирт, 100 % ацетон, эпоксидные смолы (на основе эпона), катализатор полимеризации (тридиметиламинофенол), уранилацетат, цитрат свинца, деионизированная вода |
| Процедура подготовки срезов тканей и органов животных для определения наноматериалов методами электронной микроскопии | |
| Подготовка реактивов и материалов к эксперименту | – приготовление 0,1 М фосфатно-солевого буфера (рН 7,2-7,4); – приготовление 1 % раствора четырехокиси осмия на фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4); – приготовление батареи водных растворов этанола возрастающей концентрацией (50%, 60%, 70%, 80%); – приготовление заливочной эпоксидной смолы; – приготовление смесей ацетона и эпоксидной смолы в объемных соотношениях 3:1, 1:1, 1:3; – приготовление раствора цитрата свинца; – приготовление 2,0 % раствора уранилацетата в 70% этаноле |
| Подготовка исследуемых материалов к приготовлению ультратонких срезов для определения наноматериалов методами электронной микроскопии | Образцы материала в фиксирующем растворе (2,5 % раствор глутарового альдегида на 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 с добавлением 2% нейтрального формалина) разделяют на две равные группы для проведения анализа в присутствии контрастирующих агентов и на неконтрастированных срезах. |
| Приготовление ультратонких срезов образцов тканей и органов животных для определения наноматериалов методами электронной микроскопии в присутствии контрастирующих агентов | – фиксирующий раствор отмывают 2 см3 0,1 М фосфатно-солевого буфера (рН 7,2–7,4); процедуру повторяют всего 3 раза; – пробу материала дополнительно фиксируют в 2 см3 1,0 % раствора четырехокиси осмия на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре; – образец обрабатывают 2 см3 водного 50 % раствора этанола в течение 20 мин при 4 °С; процедуру повторяют до получения визуально прозрачного водно-спиртового смыва; – образец обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С; – образец повторно обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С; – образец обрабатывают 2 см3 1 % раствора уранилацетата в 70 % этаноле в течение 12 ч при 4 °С (оставляют на ночь в холодильнике); - образец обрабатывают 2 см3 80 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре; - образец обрабатывают 2 см3 96 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре; - образец обрабатывают 100 % ацетоном 3 раза по 45 мин при комнатной температуре; – образец пропитывают в трех сменах ацетона и эпоксидной смолы с восходящей концентрацией смолы (1:3, 1:1, 3:1 по объемному соотношению смолы и ацетона); время пропитки составляет 2 ч для смесей 1:3 и 1:1 и 12 ч для смеси 3:1 при комнатной температуре; – образец помещают в эпоксидную смолу на 2 ч для пропитки; – образец помещают в заливочную форму, заполненную эпоксидной смолой с добавлением катализатора, и полимеризуют в течение 24 ч при температуре 37 ºС, а затем в течение 48 ч при температуре 60 ºС; – на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом из полимеризованного эпоксидного блока в зоне, содержащей образец, получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой; – ультратонкие срезы окрашивают цитратом свинца и 1,0 % раствором уранилацетата |
| Приготовление ультратонких срезов образцов тканей и органов животных для определения наноматериалов методами электронной микроскопии без контрастирования | – фиксирующий раствор отмывают 2 см3,1 М фосфатно-солевого буфера (рН 7,2–7,4); процедуру повторяют всего 3 раза; – образец обрабатывают 2 см3 водного 50 % раствора этанола в течение 20 мин при 4 °С; процедуру повторяют до получения визуально прозрачного водно-спиртового смыва; – образец обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С; – образец повторно обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С; – образец обрабатывают 2 см3 водного 70 % раствора этанола в течение 12 ч при 4 °С (оставляют на ночь в холодильнике); - образец обрабатывают 2 см3 80 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре; - образец обрабатывают 2 см3 96 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре; - образец обрабатывают 100 % ацетоном 3 раза по 45 мин при комнатной температуре; – образец пропитывают в трех сменах ацетона и эпоксидной смолы с восходящей концентрацией смолы (1:3, 1:1, 3:1 по объемному соотношению смолы и ацетона); время пропитки составляет 2 ч для смесей 1:3 и 1:1 и 12 ч для смеси 3:1 при комнатной температуре; – образец помещают в эпоксидную смолу на 2 ч для пропитки; – образец помещают в заливочную форму, заполненную эпоксидной смолой с добавлением катализатора, и полимеризуют в течение 24 ч при температуре 37 ºС, а затем в течение 48 ч при температуре 60 ºС; – на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом из полимеризованного эпоксидного блока в зоне, содержащей образец, получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой |
Таблица 5.
Подготовка образцов для определения наночастиц методами ПЭМ в тканях и органах растений
| Вид исследуемого материала | фрагменты тканей и органов растений (корешков и листьев) |
| Физическая форма исследуемого материала | изолированные кусочки тканей и органов растений, фиксированные в 2,5 % глутаровом альдегиде на 0,1 М буфере Зоренсена, рН 7,2-7,4, с добавлением 15 г/л сахарозы |
| Количество материала для выполнения исследований | по 2 кусочка каждого вида образцов (из одного органа или гистологически выделяемого типа ткани) |
| Приборное обеспечение | Термостат, холодильник, вытяжной шкаф, рН-метр, электромешалка, ультрамикротом |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой, автоматические пипетки вместимостью 1 см3 и 200 мм3, наконечники к автоматическим пипеткам, пипетки вместимостью 5 см3, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3 пенициллиновые флаконы вместимостью 10 см3, мерный цилиндр вместимостью 100 см3, стеклянные или алмазные ножи для ультрамикротома |
| Химические реактивы | натрий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, сахароза, 96 % этиловый спирт, 100 % ацетон, эпоксидные смолы (на основе эпона), катализатор полимеризации (тридиметиламинофенол), деионизированная вода |
| Процедура подготовки срезов тканей и органов растений для определения наноматериалов методами электронной микроскопии | |
| Подготовка реактивов и материалов к эксперименту | – приготовление 0,1 М буфера Зоренсена (рН 7,2-7,4) с добавлением 15 г/л сахарозы; – приготовление батареи водных растворов этанола возрастающей концентрацией (20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%); – приготовление заливочной эпоксидной смолы; – приготовление смесей ацетона и эпоксидной смолы в объемных соотношениях 3:1, 1:1, 1:3 |
| Приготовление ультратонких срезов образцов тканей и органов растений для определения наноматериалов методами электронной микроскопии (без контрастирования) | – фиксирующий раствор отмывают 2 см3,1 М буфера Зоренсена (рН 7,2–7,4) с добавлением 15 г/л сахарозы; процедуру повторяют всего 3 раза; – образец дегидратируют, инкубируя в водных растворах этанола возрастающей концентрации (20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%) в течение 30 мин при комнатной температуре; – образец инкубируют в 70 % растворе этанола в течение 12 ч при комнатной температуре; - образец инкубируют в 80 % растворе этанола в течение 30 мин при комнатной температуре; - образец инкубируют в 96 % растворе этанола в течение 30 мин при комнатной температуре; - образец обрабатывают 100 % ацетоном 2 раза по 60 мин при комнатной температуре; – образец пропитывают в трех сменах ацетона и эпоксидной смолы с восходящей концентрацией смолы (1:3, 1:1, 3:1 по объемному соотношению смолы и ацетона); время пропитки составляет 24 ч для смеси каждого состава при комнатной температуре; – образец помещают в заливочную форму, заполненную эпоксидной смолой с добавлением катализатора, и полимеризуют в течение 24 ч при температуре 37 ºС, затем в течение 24 ч при температуре 45 ºС, затем в течение 24 ч при температуре 60 ºС; – на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом из полимеризованного эпоксидного блока в зоне, содержащей образец, получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой |
Выявление и определение характеристик наночастиц в биологических образцах проводится в порядке, изложенном в таблице 6.