Просмотр сеточек (бленд) с исследуемым материалом проводят в просвечивающем электронном микроскопе при увеличениях 20000-100000 крат и ускоряющем напряжении не менее 80 кВ. При низких увеличениях проводят предварительную оценку качества образца. Визуально (по изображению на мониторе рабочей станции) исследуют образец при низких и высоких разрешениях на предмет наличия структур, обладающих морфологическими признаками техногенных наночастиц. Используя ПЗС-матрицу электронного микроскопа, получают и сохраняют с оптимальным разрешением цифровые изображения 5-6 полей, содержащих предполагаемые наночастицы. Такой целенаправленный поиск наночастиц позволяет уменьшить вероятность получения ложноотрицательного результата.
Затем для получения статистически значимой выборки данных, характеризующих частоту встречаемости наночастиц в пробе или их плотность распределения в образце, получают и сохраняют с оптимальным разрешением изображения 30 случайным образом выбранных полей образца. Для этого рекомендуется наметить произвольную линию, проходящую через весь образец и вдоль этой линии измерить 30 равномерно отстоящих друг от друга изображений в режиме просвечивающей электронной микроскопии. Если в образце обнаружены единичные области неоднородного скопления наночастиц, то линия, вдоль которой измеряются изображения, по возможности, должна пройти мимо этих областей. Для обеспечения равномерности измерений вдоль выбранной линии между последовательными измерениями рекомендуется пропускать одинаковое число полей зрения. Для подсчета пропускаемых полей рекомендуется использовать дефекты подложки или неоднородности образца, контролируя по ним перемещение образца. Также для подсчета пропускаемых полей зрения можно использовать подсчет числа поворотов ручки, отвечающей за перемещение образца. Количество пропускаемых полей зрения меняется прямо пропорционально используемому увеличению: при увеличении 50000 расстояние между регистрируемыми изображениями составляет 10-30 полей зрения; при увеличении 100000 пропускается 20-60 полей зрения; при увеличении 10000 пропускается 2-6 полей зрения.
Если в области образца, от которой предполагается регистрировать изображение, наночастицы отсутствуют, то записывать изображение в файл не следует, однако количество таких областей должно быть посчитано и учтено при анализе плотности и однородности распределения наночастиц по образцу, выполняемом на основе серии равномерных измерений вдоль линии.
Измерение изображений в режиме просвечивающей электронной микроскопии дополняется (в зависимости от типа анализируемых наночастиц) измерениями в режиме дифракции электронов или СХПЭЭ. Цель измерений в режимах дифракции электронов и СХПЭЭ – получение данных для идентификации электронно-контрастного материала и обоснованного отнесения его к определяемым наночастицам.
6.4.1. Воздушные системы окружающей среды
В аппарате Кротова или в его аналогах помещают чашку Петри диаметром 8,5 см с 20,0 см3 дистиллированной воды. Затем включают аппарат на 10 мин для прокачки воздуха с определенной скоростью из окружающей среды, которая устанавливается по шкале. На входе аппарата устанавливают фильтр для отсечения крупных частиц. Прибор градуируется, регулярно проверяется метрологической службой.
На пять электронно-микроскопических медных сеточек, покрытых формваровой или коллодиевой пленкой, наносят по одной капле суспензии частиц из воздуха (50-100 мм3), через 1 мин удаляют всю жидкость с поверхности сеточки и при необходимости окрашивают 1,0 % раствором уранилацетата. Параллельно на электронно-микроскопических сеточках препарируют контрольные образцы с искомыми наночастицами. Для этого на электронно-микроскопических сеточках наносят водную суспензию одного вида наночастиц или водную суспензию нескольких видов наночастиц, выпускаемых предприятиями, расположенных в зоне отбора проб воздуха.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в различных воздушных системах окружающей среды представлена в таблице 1.
Таблица 1.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в различных воздушных системах окружающей среды
| Объект исследования | Воздушная среда предприятий, цехов, коммунально-бытовых помещений |
| Физическая форма объекта исследования | Газообразная |
| Количество материала для выполнения исследований | 10,0 м3 |
| Приборное обеспечение | Аппарат Кротова для отбора проб воздуха, просвечивающий электронный микроскоп, соответствующий п. 6.1.1 |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, чашки Петри, автоматическая микропипетка на 100 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата. Этап 2 (препарирование образцов наноматериалов для электронной микроскопии): – чашку Петри с дистиллированной водой помещают в аппарат Кротова и выдерживают в потоке воздуха 10 мин; – на электронно-микроскопических сеточках наносят по одной капле суспензии частиц из воздуха (50-100 мм3), через 1 мин удаляют всю жидкость с поверхности сеточки и окрашивают (если необходимо) 1,0 % водным раствором уранилацетата. – сеточки с наноматериалом контрастируют 1,0 % раствором уранилацетата в течение 1-2 мин. |
| Исследование образцов (проб воздуха) в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений структуры твердой фракции проб воздуха | Основные этапы: – визуализация наночастиц в пробах воздуха; – морфометрический анализ наночастиц; – определение степени полиморфизма; – определение коэффициента формы наночастиц; – определение степени агрегированности наночастиц в воздухе; –определение степени загруженности воздуха наночастицами (количество частиц на единицу объема воздуха) |
| Основные параметры и характеристики твердой фракции воздуха для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в пробах воздуха; – уровень электронно-оптической плотности частиц – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в воздухе; – степень агрегированности частиц в пробах воздуха. |
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в пробах воздуха содержат информацию о форме, тонкой структуре (наличие канала, полости, пустот, структура рельефа поверхности частиц и др.) и размерах наночастиц, данные о степени агрегированности наночастиц, электронные изображения частиц, гистограммы, отражающие структурные и морфометрические особенности наночастиц в исследуемых пробах воздуха.
Образцы средств бытовой химии, косметических средств, лекарств и пищевых продуктов суспензируют или растворяют в дистиллированной воде.
На пять электронно-микроскопических медных сеточек, покрытых формваровой или коллодиевой пленкой, наносят по одной капле суспензии или раствора исследуемого образца (50-100 мм3), через 1 мин удаляют всю жидкость с поверхности сеточки и при необходимости окрашивают 1,0 % водным раствором уранилацетата в течение 1-2 мин.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в средствах бытовой химии, косметических средствах, лекарствах и пищевые продуктах в порошкообразной и жидкой формах.
| Вид продукта, наноматериала | Промышленные товары, лекарства, пищевые продукты |
| Физическая форма продукта, наноматериала | Порошок, суспензия, раствор |
| Количество материала для выполнения исследований | 50-100 мг (0,5-1,0 см3) |
| Приборное обеспечение | просвечивающий электронный микроскоп, соответствующий п. 6.1.1 |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1 (подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата. Этап 2 (препарирование образцов наноматериалов для электронной микроскопии): – суспензию или раствор наноматериала наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой (коллодиевой) пленкой; – при необходимости сеточки с наноматериалом контрастируют 1,0 % раствором уранилацетата |
| Исследование образцов наноматериалов в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений структуры наноматериала (продукта) | Основные этапы: – визуализация наночастиц в структуре наноматериала или продукта; – морфометрический анализ наночастиц; – определение степени полиморфизма наночастиц в материале; – определение степени агрегированности наночастиц в материале. |
| Основные параметры и характеристики наноматериала (продукта) для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в образце; – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в материале; – степень агрегированности частиц в наноматериале. |
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в продукции содержат информацию о форме и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степени агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, электронно-микроскопические изображения частиц и структуры продукта.